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沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌,其减毒后具有良好的侵袭能力,在体内生长缓慢,能够有效地持续刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。但是经过改造过的病原菌,要么过度减毒,损伤了免疫原性；而当保留了较好的免疫原性,细菌却不够减毒,引起宿主的各种临床症状。本文以野生型猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为载体,利用细菌分子生物学技术,对猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3染色体进行基因改造,使猪霍乱沙门氏菌突变株在甘露糖和阿拉伯糖的调控下,其毒力逐渐减弱的同时,所携带的外源抗原的表达得以不断提高,最终使减毒株在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达而毒力减弱,以保障疫苗候选株的安全性,然而其质粒所携带的外源抗原的表达能够不断提高。本研究在C78-3中共引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA四个突变,该减毒株被命名为x0011；将猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(简写为6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成疫苗候选株χ0011(pYA6-PGD);最后对χ0011(pYA6-PGD)的生物学特性进行了分析。1.减毒猪霍乱沙门氏菌x0011的构建本部分在猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3上分别引入由甘露糖调控的△manA突变和由阿拉伯糖调控的△Pcrp::TT araC PBAD crp和△relA::araC PBAD lacI TT突变。△manA突变使突变菌的manA基因在没有甘露糖时不能表达,导致突变菌不能合成细菌LPS O-抗原的侧链而减毒；△Pcrp::TT araC PBAD crp是在没有阿拉伯糖时,突变菌的crp基因不能表达,导致突变菌不能合成crp蛋白而减毒；△relA::araC PBAD lacI TT突变是由阿拉伯糖控制lacI基因的表达,从而使外源基因在没有阿拉伯糖的动物机体内可以高效表达；引入的AasdA突变使减毒株(asdA-)与蛋白表达载体pAY3493(asdA+)形成平衡致死系统,使得只有携带外源抗原质粒的疫苗候选株才能稳定地在动物机体内复制。依据无抗性标记缺失基因的自杀载体方法,首先分别构建含缺失基因△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和AasdA结构的自杀载体；即在GenBank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列,找到在猪霍乱沙门氏菌上拟缺失基因或启动子的上下游序列,在上下游基因中设计引物,以上下游基因的300bp左右为同源臂,删除拟缺失基因或启动子序列,以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板,经PCR等分子生物学技术,获得删除基因或启动子序列后与C78-3有500-600碱基的同源臂序列,将此同源臂序列连接至自杀载体质粒pRE112(pRE118)上,通过酶切鉴定和序列测定,将正确缺失基因或启动子序列的pRE112载体转化至工程菌大肠杆菌x7213中,获得自杀载体x7213(pYAs001)(△Pcrp::TT araC PBAD crp),χ7213(pYAs002)(△manA), χ7213(pYAs003)(△relA::araC PBAD lacITT)和χ7213(pYAs004)(△asdA).然后以猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为受体菌,含自杀性质粒的x7213为供体菌,运用自杀载体介导的同源重组技术,在C78-3上分别引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA,最后获得χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lacI TT和△asdA)减毒株。2.减毒猪霍乱沙门氏菌载体x0011生物学特性的研究本论文的目的是用基因调控的方法,使减毒载体在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的侵袭能力,侵入宿主后使毒力基因失表达而减毒,以保障疫苗候选株的安全性。为验证本研究中x0011减毒株是否达到论文设计的目的,首先将猪链球菌Ⅱ型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成表达6-PGD蛋白的原核表达质粒pYA6-PGD,再将pYA6-PGD转化至减毒株x0011中,成为致死/平衡系统的χ0011(pYA6-PGD)(见第三章)。经过测定χ0011(pYA6-PGD)减毒株在Balb/C小鼠中的LD50和定居能力、在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力,发现x0011(pYA6-PGD)的毒力比亲本强毒株C78-3明显减弱(减弱106倍),而与疫苗弱毒株C500相似；定居实验表明χ0011(pYA6-PGD)在小肠的派伊尔氏淋巴结定居能力较强,在肝脏和脾脏的定居能力弱于强毒株；尤其是(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力体现了逐渐减毒的特性,即在入侵猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞后24h, χ0011(pYA6-PGD)的入侵能力与野毒株C78-3相当,而疫苗弱毒株C500己明显弱于减毒株χ0011(pYA6-PGD)(p<0.01)：在入侵猪肺巨噬细胞和和猪外周血单核细胞48h和72h,x0011(pYA6-PGD)入侵的能力明显弱于野毒株C78-3(p<0.01),但是却明显强于疫苗弱毒株C500(p<0.01)。3.携带猪链球菌6-PGD蛋白减毒沙门氏菌载体构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)在多种细菌中具有较高的保守性,据报道猪链球菌6-PGD蛋白具有较好的免疫原性。本研究参照已经报道的猪链球菌2型的6-PGD基因序列(GI：8151617),设计引物扩增出6-PGD基因(1428bp),连接至原核表达载体pET28a上,转化至大肠杆菌BL21,将表达和纯化的6-PGD蛋白免疫新西兰大白兔,获得针对6-PGD蛋白的多抗血清：然后将6-PGD基因插入原核表达载体pYA3493,电转化入x0011减毒沙门氏菌载体,命名为x0011(pYA6-PGD), Western-Blot检测表明减毒株χ0011(pYA6-PGD)可以高效表达6-PGD蛋白：质粒pYA6-PGD在x0011中可以稳定传代表达60代；将减毒株x0011(pYA6-PGD)免疫6周龄的Balb/c小鼠可以诱导很高的针对6-PGD蛋白IgG抗体；以14×LDso的猪链球菌2型剂量腹腔攻毒经2次免疫的Balb/c、鼠,发现χ0011(pYA6-PGD)仅能延长小鼠的存活时间,没有得到预期的保护效果。以上实验结果表明,本研究构建的χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp, AmanA,△relA::araC PBAD lacI TT和AasdA)减毒株获得了在入侵宿主机体时具有像野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3一样强的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达其毒力明显减弱,具备了疫苗候选株安全性的特性：携带猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)外源抗原的x0011免疫Balb/c小鼠可诱导较高的对6-PGD蛋白的IgG抗体。