前言间质性肺疾病(ILD)是由200余种疾病组成的一类疾病,他们在临床表现、实验室和病理学改变上具有一定共同特点,但又有各自不同的特征。肺纤维化的典型病理学过程为肺泡上皮损伤,炎性细胞聚集,成纤维细胞过度增殖,细胞外基质沉积,成纤维细胞增殖灶,以及蜂窝肺的形成。博莱霉素可导致啮齿类动物急性肺损伤和肺纤维化,这一特点为研究肺间质纤维化提供了成熟的动物模型。核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是重要的转录因子,调节许多炎症性细胞因子的转录,P65是其重要的功能亚单位。研究显示,在BLM诱导的肺间质纤维化病理过程中,NF-κB的表达明显增强。成纤维细胞分化为表达α-平滑肌动蛋白的肌成纤维细胞在肺间质纤维化病理过程中具有重要作用。本实验以博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型为研究对象,应用免疫组织化学方法,旨在阐明NF-κB P65、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)在肺纤维化发生发展中的动态变化,揭示NF-κB活化与α-SMA蛋白表达的相关性,研究NF-κB活化在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中的作用,从而探讨肺间质纤维化的发病机理,为其治疗提供新的治疗靶点和理论实验依据。材料与方法一、实验材料8周龄雌性C57BL/6小鼠(体重17～20克),无特殊病原体SPF级(北京维通利华实验动物技术公司),寄养于中国医科大学附属盛京医院动物中心,博莱霉素A2(BLM—A2)15毫克/支(日本化药株式会社,批号:H20040205),小鼠抗人NF-κB P65单克隆抗体,小鼠抗人α-SMA单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。二、实验动物模型的建立、分组与标本处理1、实验动物模型建立、分组将60只C57BL/6雌性小鼠随机分为实验组与对照组。所有实验小鼠均用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,无菌手术暴露气管进行模型制作。实验组(BLM组):50只,第0天向每只小鼠气管内分别注射20 ul含BLM-A2(5mg/kg)的无菌生理盐水。对照组:10只,第0天气管内注入生理盐水20 ul。2、标本的采集与处理在实验的第1、3、7、14、28天对实验组取材,每次随机选取10只。第7、14天对对照组取材,每次随机选取5只。以腹腔主动脉放血法处死实验小鼠,留取肺组织。将左肺完整取出,放入4%多聚甲醛中固定3 h,常规石蜡包埋,制成4μm厚的组织切片。三、肺组织常规病理分析1、常规病理肺组织经不同浓度酒精常规脱蜡至水,行HE染色和Masson染色。2、肺泡炎症及纤维化程度的组织病理学评分方法依照Szapiel法确定肺泡炎症及纤维化程度,两者均分4级,分别记为1、2、3、4分。四、实验方法及检测指标应用免疫组织化学技术(SP法),检测肺组织内NF-κB P65、α-SMA蛋白的定位及表达。五、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行分析,所有数据均以均数±标准差表示,计量资料组间比较采用独立样本t检验,组内不同时间点比较采用单因素方差分析,单因素相关分析采用spearson相关分析法,P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果一、肺组织的病理变化肺组织病理HE染色显示,对照组未见明显的炎症细胞及大片实变改变。实验组小鼠经气管注射BLM后第3天,可见肺泡壁略增宽,肺泡腔和肺间质内有炎性细胞渗出;第7天,肺泡间隔增厚,局部肺泡萎陷,肺泡腔内可见渗出改变,内有大量炎症细胞浸润;第14、28天肺泡炎开始消退,肺泡间隔明显增厚,大量肺泡萎陷,结构破坏,形成多发片状实变,实变组织内可见大量细胞浸润。Masson三色染色提示,对照组肺组织含有少量胶原纤维,为ECM的主要组成部分。模型组小鼠早期(第7天)即出现胶原纤维沉积,后期随时间推移,胶原纤维沉积逐渐增多,纤维化程度逐渐加重,28天时可见在大片实变组织内出现大量的胶原沉积,形成典型的间质纤维化改变。二、肺泡炎症及纤维化程度的病理学评分结果1、肺泡炎症程度病理学评分气管注射博莱霉素后各时间点,肺泡炎症评分与对照组比较(1.0±0.00)均有统计学意义(P＜0.01)。第7天肺泡炎病理评分最高,为3.6±0.52。2、肺纤维化程度评分气管注射博莱霉素后,第7天开始形成纤维化(与对照组比较,P＜0.01),随时间的延长,肺组织纤维化的程度逐渐加重。28天后,肺纤维化病理评分为3.8±0.42,肺纤维化病理改变最明显。三、肺组织NF-κB P65和α-SMA的免疫组化染色结果1、肺组织NF-κB P65免疫组化染色结果在实验组小鼠肺组织中,可见巨噬细胞、肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮细胞及血管内皮细胞P65免疫组化染色呈阳性,且可见多数胞核呈阳性表达。正常对照组小鼠肺组织上述细胞仅部分胞浆呈弱阳性染色,未见细胞核着色,且第7天与第14天比较无差异(P＞0.05)。实验组各时间点的P65表达均较正常对照组明显升高(P＜0.001)。气管注射BLM后第1天,表达水平明显高于3天、7天、14天和28天(P＜0.01),第3天表达较第1天降低(P＜0.01),并呈逐渐下降趋势,但28天仍明显高于对照组(P＜0.01)。2、肺组织α-SMA免疫组化染色结果在正常对照组小鼠肺组织中,α-SMA仅在较大血管、支气管壁的平滑肌细胞的胞浆中呈明显的阳性表达。实验组则除支气管平滑肌细胞、血管平滑肌细胞外,还可在肺间质细胞的胞浆中见到表达。气管注射BLM后,各时间点与对照组比较,α-SMA蛋白的表达均明显增强(P＜0.01),且随时间的推移进一步增高,14和28天表达最强(P＜0.05)。四、NF-κB P65和α-SMA表达的相关性分析气管注射BLM后早期(0～3天),P65与αSMA呈正相关(r=0.529,P＜0.01)。结论1、BLM所致小鼠肺纤维化过程中,早期NF-κB即开始活化并持续表达。2、成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化可能在肺间质纤维化病理过程中具有重要作用,NF-κB活化可能是促使成纤维细胞表型转化的关键因素。