目的:在全球范围内,肺癌的发病率及死亡率位于常见恶性肿瘤的前列,揭示其病因及发病机制对于肺癌的有效治疗意义重大。我们前期研究表明,Pim-1在非小细胞肺癌组织(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)中过表达,并且其过表达可以促进NSCLC细胞的增殖以及肿瘤迁移等过程,发挥癌基因的作用。但是,目前有关Pim-1在NSCLC中过表达的机制尚不清楚。真核细胞翻译起始因子4E(e IF4E)作为重要的真核细胞翻译起始因子,可增加一些癌基因在蛋白水平的合成过程。e IF4E是否参与NSCLC中Pim-1的表达调控尚不清楚。鉴于此,本实验旨在研究e IF4E在NSCLC中的表达及作用,同时分析e IF4E对Pim-1表达的调控作用。方法:1免疫组织化学方法采用免疫组织化学ElivisionTMplus三步法,检测Pim-1与e IF4E蛋白在福尔马林固定石蜡包埋NSCLC组织中的表达。在此基础上,分析Pim-1与e IF4E表达与临床病理学特征的相关性,并对二者表达的相关性进行分析。2细胞培养人肺癌细胞H1299、A549、H157、H460和H358,培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的1640培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。取对数生长期的培养细胞,用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,进行细胞传代以及细胞的收集,进行相关研究。3 si RNA转染使用100 pmol e IF4E特异性si RNA瞬时转染H1299和A549细胞,同时转染Negtive control si RNA(NC si RNA)作为阴性对照。体外观察e IF4E在NSCLC中的作用及对Pim-1的表达的影响。4 MTT比色法分别于e IF4E si RNA转染后0h、24 h、48h、72h和96h,采用MTT方法检测对H1299及A549细胞的生长情况;不同浓度吉非替尼处理48h后进行MTT检测,绘制细胞生长曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。此外,分别于Pim-1 si RNA或e IF4E si RNA转染联合吉非替尼(gefitinib)处理细胞后进行MTT检测。5蛋白免疫印迹(Western blot)e IF4E si RNA转染H1299、A549细胞48h后提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法检测e IF4E si RNA转染后e IF4E和Pim-1蛋白表达情况,并计算其相对表达量。采用Odyssey仪器进行显色分析,Bio-LD图像分析系统进行定量分析。6 Real-time PCR转染处理H1299和A549细胞48h后,应用Real-time PCR方法检测细胞中Pim-1和e IF4E m RNA的表达情况。采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法计算,计算目的基因的相对表达量。7统计应用SPSS Statistics17.0软件,数据分析采用两样本t检验、χ2检验、spearman等级相关分析及曲线拟合;计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 e IF4E蛋白在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的关系免疫组织化学染色结果表明,e IF4E蛋白的阳性着色定位于肿瘤细胞的胞浆中。在69例NSCLC石蜡组织中有56例呈阳性表达,阳性表达率为81.1%(56/69)。进一步分析发现,e IF4E蛋白的表达与肿瘤大小密切相关(P=0.036),但是与其他重要临床病理特征无显著相关性(P>0.05)。2 e IF4E si RNA转染对NSCLC细胞生长与迁移的影响体外培养A549和H1299细胞,将e IF4E si RNA转染细胞后,从细胞生长与迁移方面观察e IF4E在NSCLC中可能的作用。2.1 e IF4E si RNA干扰效率的检测我们选取e IF4E蛋白高表达的A549和H1299细胞进行e IF4E si RNA干扰实验,于转染后48小时收集细胞进行干扰效率的检测。Real-time PCR结果显示,与NC si RNA对照组相比,e IF4E m RNA的表达在A549细胞和H1299细胞e IF4E si RNA转染组细胞中分别降低了83%和80%。Western blot检测结果同样表明,e IF4E蛋白的表达在e IF4Esi RNA转染组明显低于对照组。上述结果表明,所用e IF4E si RNA序列可以有效干扰e IF4E的表达。2.2 e IF4E si RNA转染对细胞生长作用的影响MTT检测结果表明,A549及H1299细胞的存活率在e IF4E si RNA转染后48h、72h和96h时均明显低于对照组(P<0.05),并且随着时间增加抑制细胞生长的作用越明显。结果提示,敲低e IF4E表达可抑制A549和H1299细胞的生长。2.3 e IF4E si RNA转染对细胞迁移力的影响细胞划痕实验结果表明,于划痕后48h,可见e IF4E si RNA转染组A549和H1299细胞朝向划痕迁移的速度明显低于对照组细胞。结果表明敲低e IF4E表达可抑制细胞的迁移能力。3 e IF4E对体外培养A549和H1299细胞Pim-1表达的影响为进一步探讨e IF4E对Pim-1在肺癌中表达的作用,我们采用si RNA干扰技术,将e IF4E si RNA转染A549和H1299细胞,从RNA和蛋白水平上对二者表达的关系进行研究。Real-time PCR结果显示,与NC si RNA对照组相比,e IF4E si RNA转染组A549和H1299细胞中Pim-1在m RNA水平的表达无显著变化。但是,Western blot检测结果表明,Pim-1蛋白的表达在e IF4E si RNA转染组明显低于对照组,尤其A549细胞下降更为明显。结果提示,敲低e IF4E表达可显著抑制细胞中Pim-1蛋白的表达。4 e IF4E与Pim-1蛋白在NSCLC组织中表达的相关性分析4.1 Pim-1蛋白在NSCLC组织中的表达及与临床病理特征的关系免疫组织化学染色结果表明,Pim-1蛋白的阳性着色部位定位于肿瘤细胞胞核和(或)胞浆。在77例NSCLC组织中有51例阳性表达,阳性表达率为66.2%(51/77),21例正常肺组织中仅有3例阳性表达,阳性表达率为14.3%(3/21),表明肿瘤组织中Pim-1蛋白的表达显著高于正常组织(P<0.001)。并且Pim-1蛋白的表达和肿瘤组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移、远端转移和临床分期密切相关(P<0.05)。4.2 Pim-1蛋白和e IF4E蛋白表达的相关性分析在69例NSCLC标本中,Pim-1和e IF4E共同阳性例数有43例,共同阴性有11例。利用spearman等级相关分析(Spearman’s rank test)发现,二者表达具有显著的正性相关关系(r=0.504,P<0.001)。5 e IF4E/Pim-1 si RNA转染联合gefitinib处理对A549和H1299细胞生长的影响5.1绘制gefitinib对A549和H1299细胞的生长曲线采用MTT检测并利用曲线拟合(curve fitting)绘制细胞生长曲线,计算半数抑制浓度(IC50)值确定gefitinib最适的作用浓度。结果表明,gefitinib对H1299、A549细胞的IC50分别为20.17μM和10.56μM,所以我们分别用20μM和10μM处理H1299和A549细胞进行后续实验。5.2 e IF4E si RNA转染联合gefitinib处理对细胞生长的影响MTT检测结果表明,A549细胞给予e IF4E si RNA联合gefitinib处理后72小时,可见细胞存活率显著低于NC si RNA联合gefitinib处理组细胞(P<0.05)。此外,给予H1299细胞e IF4E si RNA联合gefitinib处理后48h和72h,均可见细胞存活率显著低于NC si RNA联合gefitinib处理组(P<0.05)。上述结果提示e IF4E si RNA转染可以增加肿瘤细胞对靶向治疗药物gefitinib的敏感性。5.3 Pim-1 si RNA转染联合gefitinib处理对细胞生长的影响MTT检测结果表明,A549细胞给予Pim-1 si RNA联合gefitinib处理后48h和72小时,可见细胞细胞存活率显著低于NC si RNA联合gefitinib处理组细胞(P<0.05)。此外,给予H1299细胞给予Pim-1 si RNA联合gefitinib处理72h,均可见细胞存活率显著低于NC si RNA联合gefitinib处理组(P<0.05)。上述结果提示Pim-1 si RNA转染可以增加肿瘤细胞对gefitinib的敏感性。结论:1 e IF4E蛋白在人非小细胞肺癌组织中呈高表达,并且其表达与肿瘤大小显著相关。体外敲低e IF4E表达可显著抑制A549和H1299细胞的生长与迁移能力。2 Pim-1蛋白在人非小细胞肺癌常表现为过表达,并且与肿瘤的组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移、远端转移及临床分期相关。3 e IF4E与Pim-1蛋白在NSCLC中的表达呈显著正性相关关系,且体外实验表明e IF4E可在蛋白水平调节Pim-1的表达。4 si RNA转染抑制Pim-1或e IF4E的表达可以增加A549和H1299细胞对EGFR-TKI gefitinib的敏感性。