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造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment, HIM）是调控造血干/祖细胞生长发育的“土壤”,骨髓基质细胞（bone marrow stroma cells, BMSCs）是构成造血微环境的重要成分,而白血病细胞的生长依赖异常造血微环境的调控,白血病BMSCs对白血病细胞所产生的支持和庇护作用是白血病发生和难治的重要因素,探讨白血病和正常BMSCs结构功能上的差异,可以更加深入了解白血病的造血微环境,为白血病治疗寻找新的切入点。骨髓基质参与造血调控的手段主要通过BMSCs间、BMSCs与造血细胞间频繁的信号通讯得以实现。间隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式。研究发现连接蛋白43 （connexin 43, Cx43）介导的GJIC主要存在于正常BMSCs间,Cx43介导的GJIC是BMSCs调控正常造血的必要条件,而骨髓基质细胞与造血实质细胞之间以及造血细胞实质之间是否存在功能性GJIC尚有争议,苯及其代谢物导致白血病或再生障碍性贫血的发生机制与BMSCs Cx43表达降低、GJIC功能减弱有关,而正常BMSCs可通过Cx43介导的GJIC启动细胞间信号转导发挥对异常造血中白血病细胞的增殖抑制作用,以上研究结果说明Cx43介导的GJIC在正常BMSCs调控造血过程中具有极其重要的地位,而白血病骨髓基质造血调控能力异常极有可能与白血病BMSCs Cx43表达的降低或缺失、GJIC功能下降有关,从而影响了白血病细胞的增殖、分化、凋亡过程,成为白血病发生发展过程中的重要因素。鉴于此,本课题直接分离培养白血病BMSCs,检测其Cx43表达水平及GJIC功能,构建绿色荧光蛋白标记且携带Cx43基因的重组腺病毒载体并感染白血病BMSCs,将Cx43基因修饰后BMSCs与白血病细胞株（Jurkat细胞）共培养,观察其对Jurkat细胞增殖、分化、凋亡及药物敏感性的影响。从改造造血微环境角度为白血病治疗提供理论和实验依据。1.研究内容及方法:1.1体外分离培养正常人及白血病BMSCs,采用RT-PCR法、免疫细胞化学法、激光共聚焦扫描（LCSM）技术检测二者Cx43mRNA及蛋白的表达,用划痕标记染料示踪技术（SLDTM）检测二者GJIC功能。1.2采用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与腺病毒基因组进行同源重组,产生重组腺病毒质粒;在脂质体介导下,将重组腺病毒质粒转染293细胞进行包装复制,分别获得重组腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP;荧光倒置显微镜下观察转染后293细胞GFP表达,Western blot方法检测转染后293细胞中Cx43蛋白表达。1.3用重组腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP感染白血病BMSCs,采用免疫细胞化学法、RT-PCR法、LCSM技术对比感染前后Cx43蛋白表达的变化,用SLDTM对比感染前后GJIC功能的变化。1.4建立Cx43基因修饰前后白血病BMSCs与Jurkat细胞共培养模型,观察Jurkat细胞与基质细胞间的位相关系;利用MTT法检测与Cx43基因修饰前后白血病BMSCs共培养的Jurkat细胞生长曲线及DT,流式细胞术检测共培养后Jurkat细胞周期,凋亡率和死亡率,透射电镜下观察Jurkat细胞凋亡情况,免疫细胞化学法检测共培养后Jurkat细胞bcl-2、p53、bax的表达;通过MTT法和流式细胞术检测经5-FU、HHT、As2O3化疗药物作用后各组Jurkat细胞存活率及凋亡率。2.实验结果:2.1正常及白血病BMSCs Cx43表达及GJIC功能的比较:通过半定量RT-PCR法扩增出大小约为400bp的产物,与预计相符,白血病BMSCs Cx43mRNA表达相对量低于正常BMSCs （P< 0.05）;通过免疫细胞化学法和LCSM技术检测,白血病BMSCs Cx43蛋白表达量低于正常BMSCs组（P<0.01）;LCSM技术定位结果显示Cx43在胞核内均无表达表达,正常BMSCs Cx43表达主要位于胞膜,而白血病BMSCsCx43表达主要在胞质。对GJIC功能比较结果显示:染料通过正常BMSCs需通12mins,通过白血病BMSCs需8mins以上;白血病BMSCs荧光传递强度低于正常BMSCs （P<0.01）。2.2构建重组腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP:通过PCR法从质粒pcDNA3.0-Cx43扩增出1kb大小左右特异性Cx43基因片断,将Cx43基因克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒,线性化重组及未重组的穿梭质粒与pAdEasy-1同源重组后,经Pac I单酶切鉴定重组产物证明pAd-GFP、pAd-Cx43-GFP构建成功;经脂质体介导,重组质粒分别转染293细胞进行包装和复制,转染后的293细胞内均出现绿色荧光,Western blot法检测结果显示转染pAd-Cx43-GFP的293细胞在43KDa处有明显表达的条带,而pAd-GFP转染的293细胞和未经转染的293细胞在该处呈现弱表达,重组腺病毒Ad-Cx43-GFP及Ad-GFP构建成功。2.3重组腺病毒Ad-Cx43-GFP及Ad-GFP感染白血病BMSCs:感染后24h可以观察到细胞有绿色荧光表达,感染效率分别为（82.43±3.00）%和（82.29±3.27）%;半定量RT-PCR法、免疫细胞化学法和LCSM技术检测结果显示:Ad-Cx43-GFP感染后白血病BMSCs Cx43mRNA表达相对量、Cx43蛋白表达量均高于Ad-GFP感染后白血病BMSCs,差异显著;LCSM技术定位结果显示Ad-Cx43-GFP感染后BMSCs胞膜和胞质上Cx43表达明显增加。对GJIC功能比较结果显示:Ad-Cx43-GFP组BMSCs荧光传递强度明显高于Ad-GFP组（P<0.01）,染料通过时间少于Ad-GFP组。2.4 Cx43基因修饰的白血病BMSCs对Jurkat细胞调节作用:分组:Jurkat组为Jurkat细胞单独培养组,BMSCs/Jurkat组为白血病BMSCs与Jurkat细胞共培养组,Ad-BMSCs/Jurkat组为Ad-GFP感染的白血病BMSCs与Jurkat细胞共培养组,Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Ad-Cx43-GFP感染的白血病BMSCs与Jurkat细胞共培养组。①光镜下观察Jurkat细胞呈悬浮生长,细胞圆形,以散在分布为主,与白血病BMSCs共培养24h后,扫描电镜下观察可见Jurkat细胞通过伪足与白血病BMSCs层黏附生长;②描绘生长曲线结果显示:Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞（DT: 28.85h）增殖较BMSCs/Jurkat （DT: 32.42h）、Ad-BMSCs/Jurkat （DT: 31.81h）两组增殖快（P<0.01）,但较Jurkat组（DT: 26.38h）增殖延缓（P<0.01）;③各组Jurkat细胞周期分布结果显示:BMSCs/Jurkat、Ad-BMSCs/Jurkat两组间细胞周期分布及各增殖指标无显著差异（P>0.05）;Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组S期细胞比例在四组中最高、而G0/G1期细胞比例最低（P<0.01）,BMSCs/Jurkat、Ad-BMSCs/ Jurkat两组S期细胞比例低于其他两组、G0/G1期细胞比例高于其他两组;在各组细胞G0/G1期前均出现一亚二倍体凋亡峰;各组Jurkat细胞DI值均在1.9-2.1之间,显示为异倍体细胞,Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞异倍体DNA比例在四组中最低、二倍体DNA比例最高、SPF值和PI值在四组中最高（P<0.01）,BMSCs/Jurkat、Ad- BMSCs/Jurkat两组异倍体DNA比例高于其他两组,而二倍体比例及SPF值、PI值低于其他两组（P<0.01）;④经流式细胞仪检测发现各组均存在自发凋亡和死亡Jurkat细胞,Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞凋亡率和死亡率高于其他三组（P<0.01）,BMSCs/Jurkat、Ad-BMSCs/Jurkat两组间细胞凋亡率和死亡率无显著差异（P>0.05）,但均低于Jurkat组（P<0.01）。经透射电镜证实各组Jurkat细胞群中均可见凋亡细胞;免疫细胞化学法检测发现:Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞bcl-2及p53蛋白表达量低于Jurkat、BMSCs/Jurkat两组（P<0.01）,bax蛋白表达量高于Jurkat、BMSCs/ Jurkat两组（P<0.01）;而BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞bcl-2及p53蛋白表达量高于Jurkat组（P<0.01）,bax蛋白表达量低于Jurkat组（P<0.01）;⑤经不同浓度5-FU和As2O3处理后,Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞存活率低于Jurkat组和BMSCs/Jurkat组（P<0.01）,其IC50值较BMSCs/Jurkat组降低约2倍,BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞存活率最高（P<0.01）;经不同浓度HHT处理后Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组和Jurkat组细胞存活率无明显差异（P>0.05）,但均低于BMSCs/Jurkat组（P<0.01）,两组IC50值较BMSCs/Jurkat组降低约2.5倍;5-FU、As2O3和HHT均可诱导Jurkat细胞凋亡,随着药物浓度的增加,Jurkat细胞凋亡率亦逐渐增加,其中以Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞凋亡率增加显著（P<0.01）,但是当HHT达到浓度0.2mg/L后,再继续增加药物浓度,Jurkat组和Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞凋亡率无明显增加（P>0.05）,当HHT达到浓度0.5mg/L后,BMSCs/Jurkat组Jurkat细胞凋亡率亦无明显增加（P>0.05）。直线相关统计分析发现,经不同浓度的各种药物处理后各组Jurkat细胞存活率及凋亡率之间为负相关关系（P<0.01）。3.结论:3.1白血病BMSCs中Cx43表达水平低于正常BMSCs并出现表达定位异常;白血病BMSCs间GJIC功能较正常BMSCs降低;3.2 Cx43基因高表达重组腺病毒载体Ad-Cx43-GFP构建成功;Cx43基因修饰后白血病BMSCs间GJIC功能增强;3.3成功建立白血病BMSCs与Jurkat细胞共培养模型;与Cx43基因修饰的白血病BMSCs共培养后,处于增殖期及自发凋亡的Jurkat细胞增加,Jurkat细胞凋亡抑制基因bcl-2及p53表达降低,凋亡活化基因bax表达增加;3.4重建白血病BMSCs间隙连接功能使与其共培养的Jurkat细胞对5-FU、HHT及As2O3化疗药物敏感性增强,药物所致凋亡率增加,但是随着HHT浓度的增加,HHT对Jurkat细胞的生长抑制作用可能并不以诱导凋亡为主要机制。