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第一部分 Ub-Tfr系统的构建胞内体蛋白分选是泛素调控内吞作用中的关键步骤,泛素标记的蛋白被胞内体蛋白分选转运复合物(ESCRT)识别后,分选进入溶酶体途径进行降解。泛素是胞内体蛋白分选和降解调控中重要的信号,可以调节内吞的蛋白从胞内体通过MVB进入溶酶体的降解途径。Tom1L1也可以与泛素结合。PR-619是一种可逆的(DUBs)的抑制剂,可以延长Ubiquitin信号,而ESCRT复合物蛋白的Hrs和TSG101在泛素化蛋白分选过程中也起着重要作用。泛素-转铁蛋白受体Jb-TfR)融合蛋白由于有泛素的标记,使转铁蛋白受体在胞内体上被分选进入多泡体/溶酶体的降解途径,不是沿着转铁蛋白受体通路再循环内体回到细胞质膜的经典途径,在研究胞内体蛋白分选途径过程的共同机制中,成为了一个非常理想的标记。所以泛素-转铁蛋白受体表达质粒的成功构建,我们能够很好的研究胞内体分选相关蛋白的作用机制。方法：1.构建泛素-转铁蛋白表达载体采用双酶切方法,将泛素基因和转铁受体蛋白基因克隆于表达载体pCI-neo-HA中,测序正确后提取质粒。2.泛素-转铁蛋白载体的表达及鉴定测序正确的Ub-TfR表达质粒转染Hela细胞,裂解细胞,收集细胞裂解液。通过Western blot、免疫荧光等检测转铁蛋白受体的表达。3.PR-619在A431和hela细胞系中条件优化通过Western blot检测PR-619在A431和hela细胞系中的最佳条件4.Hrs和TSG101 siRNA的最佳条件优化通过Western blot检测Hrs和TSG101 siRNA干扰的最佳条件结果：1. Ub-TfR载体的构建、表达及鉴定通过酶切后连接,后送公司测序。测序正确后,转染Hela细胞,转染后裂解细胞,离心获得细胞裂解液。Western Blot鉴定蛋白分子量为95KDa,表明为目的蛋白。免疫荧光证实了泛素-转铁蛋白受体内吞后不再回到到细胞膜,而是通过内吞途径进入胞内体。2.PR-619在hela细胞和A431细胞中的最佳刺激浓度是30uM,最佳刺激时间是3小时；Hrks和TSG101 siRNA干扰的最佳条件都是是转染后48小时。结论：1.成功构建了pCl-neo-Ub-TfR表达质粒,质粒转染Hela细胞后表达的Ub-TfR蛋白明显增高。免疫荧光证实了泛素-转铁蛋白受体内吞后不再回到到细胞膜,而是进入内吞途径并进入胞内体。为进一步研究胞内体分选相关蛋白奠定了基础。2.PR-619在hela细胞和A431细胞中的最佳刺激浓度是30uM,最佳刺激时间是3小时；Hrs和TSG101 siRNA干扰的最佳条件是转染后48小时。这些条件都为进一步研究胞内体分选相关蛋白奠定了基础。第二部分 EGFR基因与EML4-ALK融合基因突变的检测近年来,肺癌由于其明显上升的发病率和死亡率,已经成为了目前死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌的主要类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌,而85%的肺癌则被诊断为非小细胞肺癌,小细胞肺癌占15%。肺癌最主要的治疗手段是综合治疗,这些综合治疗主要包括手术、放疗、化疗和分子靶向治疗。据最新研究表明,靶向药物治疗对于非小细胞肺癌患者而言是一个比较好的选择。随着人们对肺癌分子靶点不断深入的研究,特异性高且不良反应轻的分子靶向药物逐渐成为人们关注的焦点。靶向药物治疗主要是以EGFR基因和EML4-ALK融合基因等肺癌驱动基因突变为靶点的,所以肺癌在进行靶向药物治疗之前的基因检测也是非常必要的。EGFR是一种分子质量为170kDa的细胞膜受体,是一种受体型酪氨酸激酶。非小细胞肺癌的形成和发展过程中,表皮生长因子受体(EGFR)信号通路起着至关重要的作用。EGFR酪氨酸激酶区域的活化可被表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)选择性地抑制,从而其下游的信号转导可以被有效阻断,在NSCLC中的疗效比较好。所以EGFR突变是靶向药物TKI治疗效果的重要预测指标之一。EML4-ALK由棘皮动物微管查关蛋白样-4(EMIA)与渐变性淋巴瘤激酶(ALK)两者的部分基因融合而成,EML4-ALK融合基因是NSCLC中的分子靶标之一。EML4-ALK融合基因突变在非小细胞肺癌的发生发展过程中起着关键性的作用。为了给NSCLC患者的靶向药物治疗提供更为可靠的依据,EGFR基因突变和EML4-ALK基因突变的检测是很有必要的。有效的生物标志物的筛选不仅仅能够改善疗效,同时还可以提高患者治疗成功率。方法：1.EGFR基因突变检测采用PCR扩增和基因测序方法检测252例非小细胞肺癌EGFR基因外显子19和21的突变情况。2. EML4-ALK融合基因突变检测采用Realtime-PCR的方法检测EML4-ALK融合基因的突变情况。结果：1. EGFR基因突变与临床特征的相互关系252例非小细胞肺癌组织标本EGFR的突变率为38.8%(98例),其中19外显子突变率为15.8%(40例),21外显子突变23.0%(58例)。EGFR突变的患者多为女性、无吸烟史和腺癌(P<0.05),与患者年龄无关(P>0.05)。2. EML4-ALK融合基因突变与临床特征的相互关系252例非小细胞肺癌组织标本中,EML4-ALK融合基因突变率4.7%(12例)。EML4-ALK基因突变患者多为女性和年龄较小者(P<0.05),与患者吸烟史和病理类型无关(P>0.05)。3. EGFR和EML4-ALK的突变共存情况没有检测到EGFR和EML4-ALK的突变共存情况。结论：1.中国人中NSCLCs的EGFR突变率较高,在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗前进行EGFR基因突变检测很有必要。2. EML4-ALK基因突变在NSCLC的发现,使临床NSCLC患者有了一种新的可供选择的治疗方案。3. EML4-ALK融合基因突变与EGFR突变共存是罕见的现象。