论文部分内容阅读
在微藻丰富的代谢产物中,许多具有重要的生理功能和应用价值。利用基因工程技术研究微藻相关代谢产物的代谢调控或生物合成,具有重大意义。 1.别藻蓝蛋白(allophycocyanin)是藻类中一类重要藻胆蛋白,可作为免疫荧光探针使用。本文利用Design-Expert8.0软件,对基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pCDF-SLA-cpcS/pRSF-Ho1-pebS生产重组别藻蓝蛋白(holo-SA-apcA)的发酵条件进行了优化。首先,证明了IPTG对该重组蛋白表达的诱导效果优于乳糖,并选用IPTG做诱导剂,运用Plackett-Burman两水平设计对影响重组蛋白表达量的8个因素进行评价。在此基础上,选择有显著影响的3个因素,即pH、诱导温度、接种量,用最陡爬坡实验快速逼近以上3个因素的最大响应区域。最后经过Box-Behnken设计和响应面分析,得出回归方程,通过求解方程得到重组蛋白表达的最优条件为:pH8.0、诱导温度18℃、接种量4%,且验证实验结果表明,在此条件下重组蛋白表达量可达52.3mg/L,与模型方程预测值基本一致。 2.DHA是PUFAs家族的一员,具有促进婴幼儿智力发育、抗炎、抗癌等重要生理功能。本文进行了裂壶藻FAS途径DHA合成缺陷机理研究的相关工作。裂壶藻中存在两条合成PUFAs的途径:脂肪酸合成酶(FAS)途径和类聚酮合酶(PKS)途径,该藻DHA的合成主要依赖于PKS途径,推测裂壶藻中FAS途径可能存在某个或某几个酶(有研究指出可能是△12-去饱和酶)的酶活性低下导致该途径DHA合成受阻。因此本论文针对这一假设,首先,克隆到Schizochytrium sp.YJ1601聚酮合酶的两个基因片段pksB和pksC。然后,构建了pksB、pksC删除的质粒pGEM-T-easy-pksB-KO和pGEM-T-easy-pksC-KO。同时,从三角褐指藻、拟南芥及毕赤酵母中克隆△12-去饱和酶基因,构建了三个外源基因的表达载体,pBlu2SKP-pht△12/pBlu2SKP-Ara△12/pBlu2SKP-pht△12。并初步探究了裂壶藻转化的体系和条件,为将PKS途经基因删除载体和外源FAS途径基因表达载体导入裂壶藻,从失去功能和获得功能正反两方面研究FAS途径功能不健全的机理并修补这一途径奠定了基础。