QKI与TET蛋白在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究

来源 :云南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jinying5322446
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生物体胚胎的形成,首先形成生殖质,经由原始生殖细胞特化、迁移、归巢形成性腺,期间发生生殖细胞增殖和减数分裂、配子成熟等过程。其中的原始生殖细胞PGCs作为个体遗传物质的携带者,是生殖细胞发育及配子发生的关键因素,原始生殖细胞PGCs产生、扩增、迁移过程调控异常会造成个体不育、相关出生缺陷、或癌症。斑马鱼PGCs的发生由母源携带及自身细胞转录翻译的RNA及蛋白共同作用来调控,其过程受到多种RNA结合蛋白的严格调控,它通过调控RNA的各种活动,在转录和转录后水平影响基因表达。研究发现QKI蛋白作为RNA结合蛋白在脊椎动物的肌肉和神经发育中发挥着重要作用,可以调控RNA稳定性与选择性剪切,且可以影响小鼠的生殖细胞发育,但对于斑马鱼早期胚胎生殖细胞发育中的具体作用,研究得还不够清楚。为了研究RNA结合蛋白QKI在斑马鱼早期胚胎PGCs发育中的功能,通过显微注射Morpholino成功构建qki敲低(knockdown)突变体,还通过CRISPR/Cas基因编辑技术成功构建了qkib的2个敲除突变体,利用转基因Tg(vasa:EGFP)斑马鱼PGCs自带荧光和整胚免疫荧光方法,发现qki敲低实验组与WT(野生型)、CMO(Morpholino对照组)相比,在24hpf时期,NM型比例显著降低,DM型和SM型比例显著增高。后面通过收集10hpf和24hpf的胚胎的total RNA,由m RNA测序结果绘制火山图与韦恩图,发现qkia敲低实验组与WT、CMO对照组相比,与神经、肌肉发育和癌症疾病相关的差异基因的表达,进一步揭示了QKI蛋白对斑马鱼早期胚胎PGCs迁移的机理。本课题还研究了TET蛋白对于斑马鱼早期胚胎颅面咽部软骨发育的影响。TET(ten-eleven translocation)蛋白作为双加氧酶能够,催化5-甲基胞嘧啶(5m C)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),而5hm C作为表观遗传修饰的研究热点,研究发现在胚胎早期对于器官发育和身体体轴形成是必需的。通过同时显微注射tet2-MO和tet3-MO,成功构建了tet2/tet3双基因敲低实验组,利用阿尔新蓝对斑马鱼咽部软骨进行染色,同时对3dpf和5dpf的tet2/tet3双基因敲除突变体胚胎进行整胚明场拍照和软骨拍照,结果发现tet2/tet3双基因敲低实验组与WT(野生型)、CMO(Morpholino对照组)相比,咽部软骨的发育异常表型呈显著性差异。本实验主要贡献在于验证了TET蛋白敲低对斑马鱼颅面咽部软骨发育有着一定影响,并且对咽部软骨异常发育的表型进行严格的划分,为后续进一步研究TETs家族蛋白与人类骨骼发育疾病如关节炎、癌症等提供一定的理论依据。
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