云南部分石漠化区域种子内生微生物多样性及促种子萌发和致病力评估

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种子内生微生物定居在种皮、胚、胚乳等生态位,不仅能直接促进种子萌发和幼苗建立,还能通过产生次生代谢物来防治植物病害,有少数微生物对种子萌发和植物生长也会有不良影响。目前,对种子内生微生物的研究大多集中在水稻、玉米和小麦等农作物上,而关于石漠化区域内植物种子内生菌方面的研究相对较少。云南省石漠化面积居全国第二位,土壤接种剂是治理石漠化,促进生态系统恢复的有效方法之一。土壤接种剂中含有多种植物的种子,而种子中的微生物对种子的萌发和幼苗的建立发挥着重要作用。本研究对7个石漠化区域周边的次生林中植物种子的内生微生物多样性进行了调查,并对优势属促进种子萌发和对植物致病性进行了评估,主要结果如下:1.种子内生真菌多样性免培养法对34种37份植物种子的内生真菌多样性研究结果显示,有75.32%的序列能鉴定到真菌界门及以下的水平,这些序列分属于7个门:子囊菌门、担子菌门、隐真菌门、被孢霉门、壶菌门、毛霉门、球囊菌门,26个纲,57个目,108个科和135个属,其中优势属是Eremothecium、Thermomyces和Aureobasidium,隐真菌门和古根菌纲首次在植物种子中发现,种子中的古根菌纲代表了该纲中一个全新的支系。Alpha多样性显示,土茯苓内生真菌物种数目最多,白刺花的内生真菌物种多样性最低。可培养法总计分离到437株真菌,分属于36个属,23个科,14个目,7个纲和2个门:子囊菌门、担子菌门,优势属是子囊菌门的Alternaria(130株)。不同植物种子内生真菌的分离频率和种群多样性差异很大,鼠李种子内生真菌的分离频率最高,为7.88%;刺茄、红心果和木防已的分离率最低,为0.23%。与可培养法相比,免培养法检测到的内生真菌约为可培养法的4倍,免培养检测到的五个门在可培养中均未获得;而可培养中分离到的2个纲(Agaricomycotin、Exobasidiomycetes),11个科和11个属的真菌在高通量测序中未检测到,说明结合两种方法对真菌多样性调查更准确。2.种子内生细菌多样性利用免培养法对该37份植物种子的内生细菌进行研究,结果显示有2.09%的古菌,97.91%的细菌。古菌隶属于2个门:Thaumarhaeota和Euryarchaeota,2个纲,4个目,4个科和2个属;细菌隶属于15个门、45个纲、91个目、104个科和153个属,其中变形菌门(Proteobacteria)是不同种子样本中内生细菌的共有优势门,Pantoea、Ralstonia和Pseudomonas是共有优势属。枸杞样品中Alpha多样性最高,而采自相同地点青龙镇的鼠李样本Alpha多样性最低。此外,Patescibacteria多分离于水资源和空气中,本研究首次从植物种子中鉴定到该门。3.种子内生真菌促萌发功能为了评估种子内生真菌对植物的有益作用,对其中优势属的129株内生真菌进行了促番茄种子萌发作用检测,发现69.77%的菌株具有促萌发潜力,但对各种种子的促萌发能力有所差异。仅有12.22%的菌株能促进黄瓜和萝卜种子萌发,15.56%的菌株能促进白菜种子萌发。这些菌株主要分布在Alternaria,Didymella,Epicoccum和Fusarium等属中。同时,轻度干旱条件下(5%PEG-6000溶液模拟),19株菌能促进番茄种子萌发,分属于Alternaria,Botrytis,Coniothyrium,Didymella,Epicoccum,Fusarium,Pestalotiopsis,Phoma和Sarocladium 9个属。选取三株对番茄种子发芽促进效果最佳的菌株进行进一步的研究,Y4-4(D.coffeae-arabicae)、L16-1(S.zeae)、L13-6(Phoma sp.)的发酵液稀释倍数分别为80倍、60倍和60倍时对番茄种子促萌发效果最佳,发芽势、发芽指数、活力指数均有显著提高。同时,在不同程度干旱胁迫下三株菌均能促进番茄种子的萌发。对该三株内生真菌的液体发酵产物进行LCMS分析,相较于抑制种子萌发的菌株L13-5(D.americana)和Y2-6(P.crystallifera)发酵产物,三株菌发酵产物中上调的化合物多为对萌发有促进作用的氨基酸及其衍生物、酮类和醚类等化合物。4.种子内生真菌致病性挑选优势属的129株菌,对其进行致病性检测,仅有15株(11.63%)对离体番茄叶有不同程度的致病作用,分属于Alternaria,Diaporthe,Epicoccum,Fusarium,Nothophoma和Phoma,表明种子内生真菌对植物的有利作用更多一些。
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