研究背景及目的肝癌患者占据全世界所有肿瘤发生的6%和全世界由于肿瘤死亡人数的9%。根据世界卫生组织的统计,2012年,由于肝癌死亡人数估计为746000。肝癌是世界范围内由于肿瘤原因死亡的排名第二的最常见肿瘤,而其中超过一半的肝癌患者在中国。中国作为肝癌高发国家,对肝癌的诊疗迫在眉睫。随着科学的进步和发展,肝癌的治疗手段也变得多种多样,从单纯手术切除,到经肝动脉栓塞化疗(Transarterial chemoembolization,TACE),从传统化疗到生物靶向治疗,从无法手术治疗到可以进行肝移植,医生及科学研究者积极研究,并积极尝试和采取各种治疗手段以期提高患者的生存率和生存质量。虽然靶向治疗是当今肿瘤治疗的一个新的热点,但是,传统的化疗对肝癌的治疗仍然有着其不可或缺的重要作用。中国传统的中医中药具有悠久的历史。2015年中国科学家屠呦呦因为发现青蒿素获得了诺贝尔生理学和医学奖。虽然青蒿素与传统意义的中药关系不大,但是却也为我们发现新药提供了新的思路。熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)源于熊胆中,是一利次级胆汁酸。UDCA是美国FDA唯一批准用于原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)的药物。而近年来,UDCA的抑癌作用受到广泛关注。老药新用一直是科学研究中永不消退的热点之一。研究者已经发现UDCA可以抑制肿瘤生长。Brasitus TA和Bernstein CN等通过动物实验及人体的标本研究证实UDCA对于结直肠癌具有抑制作用。Lim SC等发现UDCA可以通过介导死亡受体5(Death receptor 5,DR5)和MEK/ERK途径诱导胃癌细胞凋亡。同时证明UDCA可以抑制胃癌移植瘤小鼠的生长。刘慧博士研究发现,鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200可以通过促进凋亡而达到抑制肝细胞肝癌的作用。屈文东博士研究发现,UDCA可以通过COPS5作用于肝癌细胞抑制肝细胞肝癌。UDCA抑制肝细胞肝癌的作用机制开始受到关注。2016年,日本科学家大隅良典因为在细胞自噬机制方面的研究发现被授予了 2016年的诺贝尔生理学及医学奖。自噬已经作为一个新兴热点崭露头角。自噬是细胞内和细胞外物质被运送到溶酶体而降解的这一机制的广泛定义。越来越多的研究证实自噬在抑制癌症发生中发挥重要作用。在低氧和缺氧的环境下可以诱发自噬,自噬在控制程序性细胞死亡具有重要作用,并且可以介导肿瘤相关反应。Lim SC等证明UDCA可以通过减少ATG5的表达水平诱导胃癌细胞自噬的发生。而UDCA是否通过自噬作用抑制肝细胞肝癌的发生,还没有被研究。这也是我们研究的一个切入点。另外,近年来DNA双链断裂及断裂的双链DNA重新修复一直是研究的热点和难点。人体内每一个细胞每天经受接近70000次损伤,其中75%的损伤是单链DNA损伤(single-strand DMA,ssDMA)。一部分ssDNA损伤会转变成双链DNA损伤(double-strand breaks,DSBs),尽管DSBs少见,但是更具危害性。γ-H2AX作为DNA双链锻炼的标志物已经得到了国际上的广泛认可。对于UDCA是否通过促进DSBs修复来抑制肝细胞肝癌的发生也没有相关研究,DSBs损伤修复也是我们研究UDCA对于肝细胞肝癌作用机制的一个切入点。本研究旨在从自噬和DNA损伤修复的角度,探讨UDCA对肝细胞肝癌体内以及体外的阻抑作用及作用机制,以期为后续新的肝癌治疗药物的发现和发明提供新的方向。第一部分熊去氧胆酸体外对人肝细胞肝癌细胞株生长抑制作用机制研究研究目的以肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化细胞L02为研究对象,研究体外UDCA对肝细胞肝癌细胞的抑制作用,及细胞中γ-H2AX、LC3B和P53分子表达的变化情况。研究方法1、通过CCK-8实验检测UDCA对肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7以及肝永生化细胞L02的增殖情况影响。将肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hepp3B2.1-7以及肝永生化细胞LO2用不同浓度USCA(0.6、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mmol/L)分别处理 24h,48h,721h,加 CCK-8 反应后于450nm波长处测量吸光度。2、根据CCK-8实验结果,选取肝细胞肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721和Hep3B2.1-7进行Transwell细胞迁移实验以检测UDCA作用24h后,肝细胞肝癌细胞迁移能力的变化。实验分为三组,分别为空白对照组(不加UDCA),低剂量UDCA组(加入0.8mmol/L UDCA)和高剂量UDCA组(加入1.2mmol/L UDCA)。实验操作过程按照标准的Transwell细胞迁移实验步骤进行。3、采用qRT-PCR和Western Blot检测目的分子LC3B和P53 mRNA水平和蛋白水平表达变化。实验分为三组,分别为空白对照组(不加UDCA),低剂量UDCA 组(加入 0.8mmol/LUDCA)和高剂量 UDCA 组(加入 1.2mmol/L UDCA)。实验操作过程按照标准的qRT-PCR和Western Blot实验操作步骤及相关试剂盒要求进行。4、采用qRT-PCR和Western Blot检测目的分子γ-H2AX mRNA水平和蛋白水平表达变化。实验分为三组,分别为空白对照组(不加UDCA),低剂量UDCA组(加入 0.8mmol/LUDCA)和高剂量 UDCA 组(加入 1.2mmol/LUDCA)。实验操作过程按照标准的qRT-PCR和Western Blot实验操作步骤及相关试剂盒要求进行。研究结果1、加UDCA作用24 h后,UDCA对肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B2.1-7生长抑制作用明显,且抑制作用具有剂量依赖性,随着用药量增高抑制作用有升高趋势。实验组与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。而UDCA对肝永生化细胞L02没有明显的抑制作用,实验组与对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。2、UDC对肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2和Hep3B2.1-7细胞的迁移具有抑制作用,且抑制作用具有剂量依赖性。高剂量UDCA组比低剂量UDCA组对肝细胞肝癌细胞系迁移的抑制作用更加明显。实验组与对照组,高剂量UDCA组与低剂量UDCA组的的差异都具有统计学意义(P<0.05)。3、UDCA可促进肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2细胞LC3B和p53分子mRNA水平和蛋白水平的表达增加,且促进作用具有剂量依赖性。高剂量UDCA组比低剂量UDCA组对肝细胞肝癌细胞系LC3B和p53分子表达的诱导作用更加明显。实验组与对照组,高剂量UDCA组与低剂量UDCA组的的差异都具有统计学意义(P<0.05)。4、使用UDCA后,肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2细胞中γ-H2AX分子mRNA水平和蛋白水平表达降低,且降低水平具有剂量依赖性。实验组与对照组,高剂量UDCA组与低剂量UDCA组的的差异都具有统计学意义(P<0.05)。结论1、UDCA可抑制肝细胞肝癌细胞增殖,且UDCA的抑制作用具有剂量依赖性。2、UDCA可抑制肝细胞肝癌细胞迁移,且UDCA的抑制作用具有剂量依赖性。3、UDCA可促进肝细胞肝癌细胞中分子LC3B和P53在mRNA水平和蛋白水平的表达,且UDCA的促进作用具有剂量依赖性。4、使用UDCA后,肝细胞肝癌细胞中分子γ-H2AX在mRNA水平和蛋白水平的表达减少,且减少作用具有剂量依赖性5、UDCA可能通过促进自噬作用抑制肝细胞肝癌。6、UDCA可能通过促进DSBs损伤修复抑制肝细胞肝癌。第二部分熊去氧胆酸体内对裸鼠肝细胞肝癌移植瘤模型抑制作用机制研究研究目的以肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤为研究对象,研究UDCA对肝细胞肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用及裸鼠移植瘤组织中分子γ-H2AX、LC3B和P53蛋白水平的表达情况。研究方法1、肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤模型的制备及UDCA给药。将在裸鼠体内传代后的SMMC-7721细胞用无血清的培养基悬浮,设置浓度为2×106个细胞每100ul。将悬浮细胞液皮下注入裸鼠肩后部平坦部位,培养3-4周后给药。将裸鼠模型分为三组,分别为空白对照组(不给予UDCA),低剂量实验组(90mg/kg/dUDCA)和高剂量实验组(270mg/kg/dUDCA)。2、采用观察测量、苏木素-依红染色、免疫组化和Western Blot方法对UDCA对肝细胞肝癌细胞系SMMC-7721裸鼠移植瘤抑制作用进行研究。肝细胞肝癌移植瘤裸鼠用药7-8周后,先麻醉裸鼠,对其移植瘤大小进行体外测量,并记录实验结果。然后取出移植瘤,分为两部分,一部分置于液氮中保存用于Western blot及后续实验使用,一部分置于多聚甲醛固定用于HE染色和IHC染色。研究结果1、我们选取SMMC-7721肝细胞肝癌细胞系用于裸鼠移植瘤造模,用BALB/c裸鼠为移植瘤载体。造模成功后给予UDCA,观察实验组与对照组裸鼠的一般状况。实验组和对照组裸鼠的一般状况良好,相比之下,实验组裸鼠活泼度、食欲情况、精神状态都优于对照组。UDCA可明显抑制裸鼠移植瘤大小的生长,实验组与对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。且随着UDCA剂量的增加,UDCA对移植瘤的抑制作用增强。高剂量UDCA组(270mg/kg/d)裸鼠移植瘤大小明显小于低剂量UDCA组(90mg/kg/d)裸鼠移植瘤的大小,且差异具有统计学意义(P<0.05)。2、取造模成功后,经过/不经过UDCA处理7-8周后的裸鼠移植瘤组织进行HE染色,染色结果显示UDCA可以明显促进裸鼠移植瘤的坏死,并且随着UDCA剂量的增加,坏死范围明显增大。3、对裸鼠移植瘤组织进行IHC染色和Western Blot实验。研究结果表明,UDCA可以增加裸鼠移植瘤标本中LC3B蛋白分子的表达,实验组与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。且随着UDCA剂量增加,UDCA对裸鼠移植瘤中LC3B蛋白分子表达的促进作用增强,这种增强作用也具有统计学意义(P<0.05)。4、对裸鼠移植瘤组织进行IHC染色和Western Blot实验。研究结果表明,UDCA作用后,可使裸鼠移植瘤标本中γ-H2AX蛋白分子的表达减少,实验组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,随着UDCA剂量的增加,UDCA作用后的γ-H2AX分子表达的减少作用增强,这种差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论1、UDCA可抑制裸鼠肝细胞肝癌移植瘤大小的生长,且抑制作用具有剂量依赖性。2、UDCA可促进裸鼠肝细胞肝癌移植瘤的坏死,且坏死程度具有剂量依赖性。3、UDCA可以促进裸鼠肝细胞肝癌移植瘤中LC3B和P53分子蛋白水平的表达,且具有剂量依赖性。4、使用UDCA后移植瘤肝细胞肝癌模型中γ-H2AX分子蛋白水平表达降低,且降低程度具有剂量依赖性。5、UDCA可能通过促进自噬作用抑制肝细胞肝癌。6、UDCA可能通过促进DSBs损伤修复抑制肝细胞肝癌。