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研究背景及目的目前,结直肠癌在全球肿瘤发病率中排名第三,死亡率仅次于肺癌的的恶性肿瘤,结直肠癌转移是导致结直肠癌患者生存质量差及死亡的主要原因。癌症转移涉及肿瘤细胞和肿瘤微环境之(Tumor microenviroment,TME)间的一系列复杂相互作用,其影响其生物学效力并促进肿瘤细胞停滞至远处器官。成功的转移生长依赖于癌细胞在转移级联中的每个步骤对适当的不同微环境的反应能力,转移过程中微环境对肿瘤起着指导作用。G protein-coupled receptor 63(GPR63)是课题组前期通过迁移实验,分别对迁移能力相对强弱的两组结直肠癌细胞进行测序并分析得到的与结直肠癌迁移相关的基因,它属于G蛋白耦联受体超家族(G protein-couples receptors,GPCRs)下的成员之一。GPCRs也叫做7跨膜受体家族,因为它包含7个跨膜螺旋亚基,是目前哺乳动物中最大的细胞表面受体家族,它们常常通过接受胞外的信号,如气味、激素和神经递质等,控制细胞的多种生命活动,例如增殖、分化、趋化和细胞间信号联系等,这也是临床药物研究的主要方向之一。GPR63 作为一个跨膜受体,据文献报道,1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)和二油基磷脂酸(dioleoylphosphatidic acid,LPA)是GPR63的低亲和激动剂,S1P主要由血管内皮细胞、红细胞和血小板分泌,它是一种有效的生物活性鞘脂代谢物,调节多种细胞生理过程,其中细胞生长、生存、分化、淋巴细胞转运、血管完整和细胞因子和趋化因子的产生等[1,2],目前为止,关于S1P如何影响GPR63促进肿瘤转移的机制尚不清楚。本文旨在揭示GPR63受肿瘤微环境影响促进肿瘤细胞向血管迁移的机制。研究方法利用免疫组织化学检测结直肠癌组织石蜡标本中的GPR63的表达。利用CCK8、迁移实验侵和干性成球实验等这一系列体外实验探索GPR63的在结直肠癌细胞中的生物学功能。利用迁移实验和Western Blot验证S1P对GPR63的影响,通过跨血管内皮迁移实验检验肿瘤细胞对血管迁移的能力;运用免疫共聚焦、免疫共沉淀和Src干扰实验检测GPR63与Src的相互作用,通过GSEA预测GPR63胞内活化的信号通路并通过验证Western-Blot。研究结果1.免疫组织化学检测GPR63在结直肠癌组织石蜡切片上的表达情况,结果显示GPR63在正常肠细胞呈现阴性表达,在癌组织中呈现局部癌组织阳性,呈现明显的表达异质性,GPR63阳性定位于细胞浆及细胞膜,结合临床病理信息发现,GPR63高表达与结直肠癌淋巴结转移和远处转移呈现正相关关系;2.在S1P刺激下,促进GPR63高表达结直肠癌细胞迁移侵袭并且增强其干性:在S1P的刺激下结直肠癌细胞迁移能力增强,给予FTY720阻断S1P作用时,结直肠癌细胞迁移能力收到抑制,在干性成球实验中,GPR63高表达增强结直肠癌干性能力,在CCK8和平板克隆实验中GPR63表达的差异对结直肠癌细胞的增殖无明显影响;在跨血管内皮迁移实验中,GPR63高表达促进肿瘤细胞跨血管内皮迁移;迁移实验结果显示:不给予S1P刺激的情况下,GPR63高表达不影响结直肠癌细胞迁移。3.免疫共沉淀实验显示,GPR63与Src存在相互结合;荧光共定位实验显示,GPR63与Src存在空间共定位;在干扰Src表达后,肿瘤细胞的迁移能力显著降低。GPR63的高表达可促进JAK2、stat3表达增加,Src磷酸化增加及干性增强;然而通过HUVECs细胞(人脐静脉内皮细胞)与LoVo细胞的共培养,利用血管内皮细胞分泌的S1P激活LoVo细胞表面的GPR63,使细胞内Src磷酸化水平增加,激活JAK2-STAT3信号通路,进而使结直肠癌细胞迁移能力和干性增强。结论1.GPR63在结直肠癌癌组织中表达阳性,并与淋巴结转移和远处转移呈正相关关系;2.内皮细胞分泌的S1P促进GPR63高表达结直肠癌细胞迁移及增强其干性;3.内皮细胞分泌S1P结合GPR63激活Src和JAK2-STAT3信号通路促进结直肠癌细胞迁移并增强其干性。