实验目的 向周围组织浸润和从原发灶转移到其它组织器官并形成继发肿瘤是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是影响治疗效果和患者预后的重要因素。恶性肿瘤浸润主要包括细胞粘附、基质分解和细胞转移三个步骤。浸润是转移的起始步骤，从原位癌或浸润前期发展到浸润性癌的转化中，最主要的因素是其下基底膜的破坏。基底膜主要成分包括胶原蛋白Ⅳ、类肝素类肝素硫酸蛋白多糖，层粘连蛋白和内肌动蛋白等。肿瘤细胞通过分泌蛋白水解酶破坏周围的间质组织，促进肿瘤的浸润。基底膜的化学结构和分布与淋巴转移有明显相关。研究表明，基底膜降解与促进浸润和转移有关。肿瘤细胞粘附到基底膜和细胞外基质是肿瘤细胞局部浸润和转移的途径之一。头颈鳞状细胞癌为突破基底膜和浸润相连组织的基质需产生具有降解组织细胞外基质的酶。 肿瘤细胞侵袭与转移是一个连续的过程，在此过程的不同时期有多种因素参与，其中肿瘤细胞与间质细胞间的相互作用是决定其器官特异性转移的关键。头颈鳞状细胞癌突破基底膜和浸润相邻组织基质取决于细胞表面分子、酶和能动性因子的产生。其中以其他细胞为作用靶标的生长因子(即细胞因子)发出细胞增生、分化、活化和迁移的信号，起细胞间的联络作用。与侵袭和转移密切相关的细胞因子包括金属基质蛋白酶9(MMP-9)、肝细胞生长因子受体(c-Met)、肝素酶(Heparanase，Hpa)、血管生长因子(VEGF)等。 近年，随着对肿瘤转移机理的深入研究发现一些细胞因子参与了肿瘤细胞的转移，这些细胞因子通过与受体结合并经信息传导而引发了癌细胞的运动。研究表明肝素酶(Hpa)在正常组织中的低表达或无表达，但在多种肿瘤中的表达则明显高于其来源的正常组织，这种表达的改变对于肿瘤转移的早期诊断和对患者预后评估的意义仍有待进一步研究。至今国内尚无有关肝素酶在喉癌组织中表达情况的文献报道。研究亦表明许多恶性肿瘤的生长、侵袭和转移与肝细胞生长因子(HGF)或称分散因子(scatter fac-tor，SF)的受体C一Met的信号传导异常有关。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种与细胞增殖状态有关的核蛋白，从Gl后期到M期出现于增殖细胞核内，作为细胞增殖的指标，其能有效地反映细胞增长的生物学特性，对于判断肿瘤患者的预后有重要价值。而基质金属蛋白酶(Matr玩Metalloproteinases，MMPs)又是降解细胞外基质的主要酶系。其为一组含锌的内肚酶，可降解细胞外基质成分，在血管形成及肿瘤侵袭与转移过程中起着重要作用。 为此，本实验利用现代分子生物技术对54例患者喉癌组织和10例癌旁正常喉粘膜的病理生物学因素的检测及分析，试图探讨肝素酶(he钾妞，nase，hPa)在喉癌组织中的表达与临床病理因素之间的关系及其与喉癌患者预后的关系。研究c一Met和HPa在人喉鳞癌组织中表达的病理学意义及相互之间的关系。以探讨。一Met和HPa在人喉鳞癌组织中的表达与临床病理生物学行为之间的关系及其对喉癌患者预后的影响。通过对c一MeT、PC-NA、MMP一在喉癌组织中的表达情况的研究，有助于进一步揭示三者与喉癌侵袭转移和预后之间的相互关系。最后，检测反应性增生淋巴结中是否存在微转移的发生，为进一步在分子水平上研究微转移提供研究方法。实验材料和方法 1.标本来源:收集中国医科大学附属第一临床医院1996一1997年间声门上型喉癌患者手术切除的喉鳞癌(ISCC)组织标本54例。其中男性34例，女性20例，年龄48一78岁，平均年龄58岁。10例同期喉癌旁正常粘膜为对照组织标本。 2.采用免疫组织化学染色(S一P法)和原位杂交方法检测54例声门上型喉鳞癌组织及10例癌旁正常喉粘膜组织石蜡切片中肝素酶(HPa)的表达情况。 ‘3.采用原位杂交方法对10例正常喉粘膜组织和54例喉鳞癌组织中c-Met基因和HPa基因表达状况进行检测并结合临床资料进行回顾性分析。 4.PCNA的免疫组化采用两步法;MMP一的免疫组化检测采用SABC法;分别检测54例喉癌中PCNA和MMP一的基因表达情况。 5.随机选取喉癌功能性颈廓清标本前疑似转移的淋巴结经术中冰冻报告为反应性增生淋巴结31例，经行常规皿染色的连续病理切片、广谱型角蛋白的免疫组化(P一CK)和肝细胞生长因子受体(c二Met)的功丑NA原位杂交的检测。所有淋巴结标本均行甩染色、PCK免疫组化分析、。一Met基因原位杂交检查。实验结果 1.肝素酶主要表达在癌细胞浆和/或细胞膜中。免疫组化结果显示:肝素酶在54例喉癌组织中有35例(64.8%)呈阳性表达，而在癌旁正常喉组织中无阳性表达;肝素酶表达与喉癌的临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。阳性表达组患者的五年生存率明显低于阴性组(P<0.05)。 2.不同喉粘膜病变c一Met基因表达:在正常喉组织中c一Met基因阳性表达仅见于微小涎腺的腺管细胞。而原发喉癌组织中c一Met基因阳性表达见于癌细胞浆，其阳性表达率约为51 .8%(28乃4)，且伴有颈淋巴结转移组的阳性表达率约为84%(21/25)。在颈转移淋巴结中的表达为100%，而在未转移的淋巴结中无。一Met基因表达。c一Mat基因的表达与喉癌的组织分化?