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肠激酶(EK,EC3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶,是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一,由1条结构亚基(重链)和1条催化亚基(轻链)构成,催化亚基可以特异性识别胰蛋白酶原中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下,将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶,从而启动各种酶原活化的级联[1]。
本文研究的肠激酶是酵母表达的重组激酶,其轻链接近电泳单一纯,主要是通过催化荧光底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide(简称GD4K-β-萘胺)水解跟踪法,对该酶制剂的一些活性影响因素进行研究,探讨了该酶的酶学特性、活力调控、催化作用机理,从而填补国内在这方面的研究空白。
化学修饰研究结果表明:半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基是酶的活性功能基团,而根据β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、冰醋酸、甲醛等修饰剂的修饰反应,表明二硫键、氨基不是维持酶活力的必需基团。并采用邹承鲁的底物反应动力学方法推算出酶分子中仅有一个半胱氨酸残基是酶活性所必需的,该基团的修饰将导致酶活力的丧失。
根据DTNB对该酶的强烈抑制作用,研究了其抑制动力学,DTNB对酶的抑制作用是可逆过程。从直线的斜率求得其抑制常数K1为0.11 mmol/L。DTNB在一定浓度下对酶的效应表现为慢可逆的抑制过程,对酶的抑制作用属于非竞争性抑制作用,同时建立动力学模型,测定抑制剂与游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)结合的微观速率常数k+0及k-0。
根据大规模生产中常用的变性剂种类,选取了盐酸胍、CPC、硫脲、尿素进行动力学研究,结果表明以上变性剂对该酶均具有较强的抑制活性,其IC50分别为0.025 mol/L、0.32 mmol/L、0.080 mol/L、0.75 mol/L,抑制常数K1分别为0.015mol/L、0.26 mmol/L、0.060 mol/L、0.553 mol/L,盐酸胍、硫脲、尿素对该酶的抑制作用均属于竞争性抑制作用,而CPC对该酶则显非竞争性抑制作用。同时测得CPC对重组牛肠激酶的抑制速率常数k+0及k-0。