基因编辑技术CRISPR/Cas9系统的出现从一开始便引来众多科学家的目光与研究。CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Associated Proteins9),是细菌及古细菌为抵御外来基因进化出来的获得性免疫防御机制。在利用该系统进行基因编辑时,其作用机制为Cas9蛋白在g RNA的指导下靶向切割特定目的序列引起目的序列发生双链断裂,双链断裂的DNA在细胞自身损伤修复机制的作用下对损伤DNA进行修复。基因发生损伤时,一般有两种较为普遍的修复方式:NHEJ(Non-homologous end joining,非同源末端重组)和HDR(Homologous directed repair,同源直接修复)。当基因发生损伤时,两种修复机制呈互相竞争的关系,且大部分情况下NHEJ修复通路占优。已知在NHEJ修复通路中,起重要作用的蛋白有Ku70/Ku80、PKcs、XLF、XRCC4、ligase IV、Td T、Polymeraseμ、Polymeraseλ、Polynucleotide kinase。其中XRCC4(X-Ray Repair Cross Complementing 4,X射线修复交叉补体4)与XLF(XRCC4-like factor,XRCC4样因子)、ligase IV形成复合体,XRCC4与ligase IV通过ligase IV C端BRCT(Breast cancer 1C terminus like,乳腺癌相关基因1碳末端样)结构域结合。在这个复合体中ligase IV起连接的作用,XLF与XRCC4的存在能显著增强ligase IV在NHEJ通路中的连接活性,但若没有XLF与XRCC4或其中之一的存在,ligase IV活性显著减低。在本实验中,我们将Cas9蛋白通过柔性linker与NHEJ修复通路的必需的ligase IV BRCT domain结合起来,依靠竞争性结合XRCC4来抑制正常的ligase IV行使功能,从而抑制NHEJ的发生,提高HDR的效率。为评价这一体系对HDR效率提高程度高低以及在降低NHEJ方面的影响,我们构建了基于EGFP到BFP转换报告HDR效率、基因插入或缺失导致绿色荧光猝灭报告NHEJ效率的HEK293T-AAVS1-EGFP单克隆细胞系。基于上述理论构建的px330-Cas9-32aa-p BRCT质粒在猪成纤维细胞Rosa26位点knock in EGFP序列的实验中,用流式细胞分析结果证明了其效率在px330的基础上提高了80%。随后我们利用报告细胞系,通过改变BRCT domain与Cas9蛋白串联的位置,串联所用linker的长短等对Cas9-BRCT体系进行优化。在自构建的HEK293T-AAVS1-EGFP单克隆细胞系上与原初的Cas9蛋白相比,其HDR效率提高了4.5倍。随后通过P2A‘自切割’linker对BRCT结构域的作用机制进行进一步的探索。综上所述,我们成功获得了一株能稳定报告HDR及NHEJ发生概率的HEK293T-AAVS1-EGFP细胞系,构建并优化了Cas9-BRCT串联体系,于原代细胞上证实了该体系的可行性。该体系的建立有助于我们加快各种基于精确基因编辑基础上的研究,为基因治疗,疾病模型动物的构建,各种分子机制的探索拓宽了道路。