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目的观察分化抑制因子Id1/Id3对结肠癌细胞“干性”的影响,探讨对肠癌干细胞重要的信号通路Wnt和SHH通路的影响机制。方法应用慢病毒感染系统构建Id1/Id3敲减的肠癌HCT116细胞株和Id1/Id3过表达的正常肠上皮细胞株NCM460,以及HCT116Sh-Id1、HCT116Sh-Id3细胞中过表达c-Myc的细胞株。应用实时无标记细胞检测技术(RTCA)、克隆形成实验、流式细胞周期分析检测细胞增殖水平;Western blot检测相关分子的蛋白表达情况;体外无血清悬浮培养方法检测细胞的成球能力;显微镜下观察细胞形态,分析EMT改变;分别用Wnt通路的抑制剂FH535和SHH通路的抑制剂HPI-1处理肠癌HCT116细胞48h,然后Western blot检测相关分子蛋白表达水平。结果1.HCT116细胞中的Id1/Id3基因沉默后其增殖活性及克隆形成能力明显下降(p<0.05),且增殖相关分子PCNA、Survivin及周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE蛋白水平也明显下调;PI3K/AKT通路中p-PI3K、p-AKT的表达下调。相反过表达Id1/Id3基因的NCM460细胞增殖及克隆形成能力明显上调且增殖相关蛋白的蛋白水平也明显上调。2.敲减Id1/Id3后的HCT116细胞,在无血清悬浮培养体系中形成细胞球的大小和数量也明显下降,进一步分析“干性”相关蛋白的改变,发现CD24、CD133、EPCAM、EZH2、Oct4、β-catenin、Lgr5等的表达水平明显下降,但CD44、CD166未见明显变化。而过表达Id1/Id3后的NCM460细胞,其成球能力及“干性”标志物的蛋白表达量明显增加。3.在Id1/Id3沉默的HCT116细胞中β-catenin水平明显下调,且Wnt通路的下游分子c-Myc、cyclinD1、survivin的蛋白水平也明显下降;同时SHH通路关键分子GLI1、GLI2、shh的蛋白水平明显下调,PTCH2、SUFU显著升高。用5uM、10uM的Wnt通路的抑制剂FH535和Shh通路的抑制剂HPI-1处理HCT116细胞后c-Myc、CD133等蛋白水平明显下降,且用10uM的浓度时下降更明显。4.在敲除Id1的HCT116细胞上过表达c-Myc后细胞球形成能力及“干性”相关标志物的表达量明显上调。结论1.Id1和Id3可通过上调survivin、PCNA、cyclinD1和cyclinE分子表达水平,激活PI3K/AKT通路,从而促进肠癌细胞的增殖。2.Id1/Id3对维持结肠癌细胞干性特征如维持细胞自我更新能力和成瘤能力具有重要作用。3.Id1/Id3通过Wnt和SHH通路来调控结肠癌细胞“干性”,且在此过程中c-Myc可能起重要作用。