【摘 要】
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目的线粒体活性与调控在维持细胞的增殖与凋亡平衡过程中起核心作用,且该机制与肺动脉高压的进展密切相关,但是关于线粒体如何调控这种平衡背后的分子机制尚不清楚。线粒体裂变因子（MFF）是调节线粒体活性的关键因子。本文拟通过构建体外PAH模型,探求MFF在PAH发病机制中的作用及分子机制。方法肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）无血清DMEM培养基饥饿24h后在92%N2、5%CO2和3%O2低氧条件下培养4
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目的线粒体活性与调控在维持细胞的增殖与凋亡平衡过程中起核心作用,且该机制与肺动脉高压的进展密切相关,但是关于线粒体如何调控这种平衡背后的分子机制尚不清楚。线粒体裂变因子（MFF）是调节线粒体活性的关键因子。本文拟通过构建体外PAH模型,探求MFF在PAH发病机制中的作用及分子机制。方法肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）无血清DMEM培养基饥饿24h后在92%N2、5%CO2和3%O2低氧条件下培养48h,建立体外PAH模型。通过qPCR检测和Western印迹技术检测目的基因和蛋白质表达。MTT法和EdU法检测细胞活性与增殖,JC-1测定线粒体膜电位;TUNEL法检测细胞凋亡,Mito tracker荧光染色测量线粒体周长;用荧光染料mito-SOX流式细胞技术测量ROS水平;ATP水平采用ATP检测试剂盒测定;caspase 3活性采用caspase3活性检测试剂盒测定;双荧光素酶报告基因检测验证目的基因表达的方法。结果1.与对照组相比,低氧培养下PASMCs增殖活性增加,凋亡减少（P＜0.05）,线粒体功能异常,ROS增加、线粒体膜电位与ATP的产生下降、线粒体周长减低,裂变增加（P＜0.05）。2.低氧刺激下PASMCs MFF表达水平升高,si-MFF抑制细胞活性和增殖,促进细胞凋亡增加,改善线粒体功能障碍,使线粒体ROS生成减少、线粒体膜电位和ATP增加、线粒体周长增加,线粒体裂变减低（P＜0.05）。3.低氧处理PASMCs的SIRT1和SIRT3呈低水平表达,si-MFF提高PASMCs在低氧环境下SIRT1/3的表达,这一效应可以被SIRT1/SIRT3敲除抵消（P＜0.05）。细胞功能实验结果提示:与Hyp+si-MFF组相比,SITR1/3沉默逆转了因MFF敲低后对细胞的增殖-凋亡失衡的恢复作用和对线粒体功能的保护作用（P＜0.05）。4.通过生物信息预测,利用starbase在线数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-340-5p和MFF 3’-UTR之间存在结合位点。qRT-PCR结果显示低氧诱导PASMCs miR-340-5p的表达减低,转染miR-340-5p模拟物后miR-340-5p表达增强（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-340-5p模拟物转染抑制MFF野生组的荧光素酶活性（P＜0.05）,而MFF突变组的荧光素酶活性无显著差异（P＞0.05）。miR-340-5p过表达下调MFF表达,上调SIRT1和SIRT3表达。5.利用miR-340-5p模拟物与MFF质粒共转染的方法使低氧环境培养的PASMCs的miR-340-5p和MFF的表达均上调,MFF的过表达逆转miR-340-5p对MFF的抑制作用（P＞0.05）。细胞功能实验结果显示:miR-340-5p过表达抑制低氧诱导细胞的活力和增殖,促进细胞凋亡,抑制ROS释放和线粒体裂变,提高低线粒体膜电位和ATP含量,而MFF过表达明显抵消了上述影响（P＞0.05）。结论1.MFF介导的低氧诱导PASMCs线粒体功能障碍以及细胞增殖-凋亡失衡的信号转导机制是下调SIRT1/3途径。2.miR-340-5p负性调控MFF-SIRT1/3信号轴,改善低氧诱导PASMCs的线粒体功能和细胞凋亡-增殖平衡失调。
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