钙信号调控着细胞内许多重要功能,包括短期效应如细胞兴奋-收缩偶联、分泌功能,和长期效应如基因转录、细胞增殖分化及细胞死亡。介导Ca2+内流的L型钙离子通道(L-type calcium channel,LTCC)至少包括α1,β,α2/δ等4个亚基,其中α1亚基包含有感受膜电位变化的电压感受器、决定通透离子种类的选择性滤器和各种已知的被第二信使、药物和毒素作用的结合位点等,是Ca2+通道的主要功能亚基。因此,Ca2+通道药理学、电生理学的差异主要取决于α1亚基的种类。编码LTCC α1亚基的基因有四种,分别为Cav1.1(α1S)、Cav1.2(α1C)、Cav1.3(α1D)和Cav1.4(α1F),其中心脏钙离子通道主要为Cav1.2和Cav1.3。很多研究报道LTCC对心脏电兴奋的传导和心肌的收缩功能起着非常重要的作用。钙离子通道的异常可能会导致心律失常、心肌肥大甚至心力衰竭等一系列心脏疾病的发生。新近研究发现,LTCC除了发挥其正常的生理功能外还存在另一种调节功能,即通道水解的羧基端可以参与钙信号激活基因转录的过程。骨骼肌中Cav1.1编码的α1S水解羧基端与AKAP15、PKA形成复合体,调控骨骼肌LTCC的生物学功能。心肌Cav1.2编码的α1C羧基末端的水解羧基端产物可以转运入核,结合α1C启动子区抑制其活性,进而在基因和蛋白水平抑制Cav1.2全长通道的蛋白表达,减小钙电流密度(ICa,L)。心肌Cav1.3编码的α1D羧基端通过调节肌球蛋白轻链(myosinlight chain 2,MLC2)的表达,进而促进2型小电导钾离子通道(small conductance calcium-activated potassium channel,SK2)在质膜上的定位。然而,这些并无核定位序列的离子通道,其竣基端进入细胞核的分子机制尚未澄清。有趣的是,我们的前期研究发现,Cav1.3钙通道可以与可溶性N-乙基-马来酰胺敏感因子结合蛋白受体(soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor,SNARE)蛋白家族的辅助蛋白Snapin相互作用。新近研究报道,SNARE家族蛋白Sec20p、Ufe1p、Use1p、Bos1p以及Sey1p,可直接或间接地有效调节酵母细胞的细胞核融合过程。那么,作为SNARE家族辅助蛋白Snapin会不会参与调控Cav1.3钙通道羧基端(Cav1.3-CT)核转运呢?如果参与,那么调控机制又是什么呢?为了回答这些问题,本论文以HEK293细胞和小鼠心房肌HL-1细胞为实验对象,利用细胞和分子生物学实验等相关技术对Cav1.3-CT核转运机制进行了研究。主要研究结果如下:1.确定Cav1.3-CT核分布的关键片段。将C421、C381、C286、C95、C50、C45等不同长度的Cav1.3-CT截短体构建至pEGFP-C1载体上,然后转入HEK293细胞中进行免疫荧光实验。结果显示,C421、C381、C95和C50(均包含1830-1880aa)在细胞核中有较强的荧光信号,而C286和C45(不包含1830-1880aa)在细胞质中有较强的荧光信号。这表明1830-1880aa是Cav1.3-CT入核的关键片段。2.检测Snapin的亚细胞分布。提取成年小鼠心房肌细胞和HL-1细胞的细胞质/核蛋白进行Western Blot检测。结果显示,Snapin在细胞质和细胞核中均有蛋白表达。同样,这一现象也得到了免疫荧光染色观察的支持。3.确认Cav1.3-CT与Snapin的相互作用。用成年小鼠心房肌组织和HEK293细胞裂解液进行Co-IP实验。结果证明,Snapin与Cav1.3-CT存在相互作用。有趣的是,通过免疫荧光实验发现,Snapin与Cav1.3-CT在细胞核中有共定位现象。这提示我们Snapin可能参与对Cav1.3-CT核转运的调控。4.确认Snapin对Cav1.3-CT核转运的调控。实验室前期工作表明Snapin可以影响Cav1.3通道全长的蛋白表达。然而,体外实验显示,过表达Snapin后Cav1.3-CT的蛋白表达量并没有发生显著变化,而是在细胞核中的分布显著增多。进一步用特异性siRNA干扰Snapin的表达后,Cav1.3-CT的核分布却显著减少。这说明Snapin的确参与调控Cav1.3-CT的核转运。5.Snapin介导Cav1.3-CT的核转运与二者的作用位点无关。在HEK293细胞中过表达Snapin和C95、C50、C45不同长度的Cav1.3-CT截短体后进行Co-IP实验,发现Snapin与这三种截短体均有结合。接着,将三种截短体构建至酵母表达载体上通过Y2H进一步验证,结果显示,Snapin的确与这三种截短体均存在相互作用。这表明Snapin并非通过与Cav1.3-CT入核关键片段的特异性结合而调节其核转运过程。6.Snapin介导Cav1.3-CT的核转运受到PKA磷酸化水平的调控。构建Snapin突变体S50D和S50A(PKA作用位点)、T117D和T117A(LRRK2作用位点)并转入HEK293细胞中。免疫荧光实验发现,过表达S50D可以显著提高Cav1.3-CT的核分布,而过表达S50A、T117D和T117A后Cav1.3-CT则主要分布于细胞质中。这提示Snapin对Cav1.3-CT核转运的调控可能是通过PKA磷酸化修饰来实现的。为了进一步的验证上述结果,我们用ISO处理HL-1细胞激活β肾上腺素能信号通路从而增强PKA的激酶活性,然后重复观察Cav1.3-CT入核的情况。Western Blot显示,ISO处理后Cav1.3-CT在细胞核中的表达量增加了近一倍。这表明PKA磷酸化Snapin的确可以促进Cav1-CT的核转运。综上所述,本实验研究结果表明,Cav1.3-CT序列中1830-1880aa是入核的关键片段;Snapin通过PKA磷酸化Ser50的修饰发挥对Cav1.3-CT核转运的调控作用。