抑郁症是以持续性心境低落为主要临床特征的精神障碍性疾病。世界卫生组织(WHO)预测到2030年,除心血管疾病以外,抑郁症将成为21世纪人类健康的主要杀手,是严重影响人类生活质量和社会经济发展的公共卫生和社会问题。抑郁症的病因及发病机制至今仍不十分明确,非常复杂。利用计算机断层扫描,核磁共振等影像技术检查发现抑郁症患者海马体存在与慢性应激大鼠相似的整体形态改变,表现为海马神经元缺失,包括海马神经元坏死和凋亡、海马体积减少等。因此,神经细胞损伤在抑郁症的发病中起至关重要的作用,通常认为抗抑郁药物可以通过神经保护作用来发挥其抗抑郁功效。栀子豉汤出自《伤寒论》,由栀子和淡豆豉两味中药组成。大量的中医临床研究表明栀子豉汤对于抑郁症具有良好的调节和改善作用,但其抗抑郁作用机制尚不明确。本课题采用高浓度谷氨酸处理体外培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,模拟慢性应激造成神经损伤抑郁时谷氨酸堆积的病理状态,同时采用慢性不可预测轻度应激(CUMS)联合单独饲养的方法,建立神经损伤抑郁症动物模型,分别从细胞水平和整体动物水平,构建以基于代谢组学技术的整体代谢谱和生物标志物为新指标的综合药效评价体系,揭示栀子豉汤复方基于神经保护作用的抗抑郁机制,确定栀子豉汤抗抑郁作用的药效学物质基础。具体内容如下:一、以高浓度谷氨酸刺激的PC12细胞为神经细胞损伤抑郁的体外筛选模型,分别从药效学及分子生物学角度揭示栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁配伍机制,确定栀子豉汤抗抑郁药效物质基础。(1)通过对神经损伤抑郁相关药效学指标的检测,比较栀子豉汤中栀子和淡豆豉单味药材及配伍的神经保护作用效果。结果显示栀子豉汤可以显著提高细胞存活率以及谷胱甘肽还原酶(GR)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,降低细胞凋亡率以及乳酸脱氢酶(LDH)和活性氧(ROS)水平,具有明显的神经细胞保护作用,且栀子豉汤的神经保护作用强于栀子和淡豆豉单味药材。从药效学角度揭示了栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁配伍机制。同时,通过对抑郁相关蛋白表达水平进行检测,寻找栀子豉汤抗抑郁作用靶点。结果显示栀子豉汤可以显著上调CREB和Bcl-2的表达水平,下调Bax的表达水平,从分子生物学角度揭示了栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁配伍机制。为其他抗抑郁中药复方配伍机制的研究提供了可借鉴的高通量筛选体外模型。(2)分别采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UHPLC-Q/TOF-MS)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术对栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁药效物质进行定性定量分析,成功定性鉴定出25个化学成分,并对其中六种主要活性成分京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷和大豆苷元进行了定量。明确了栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁药效物质基础。二、采用高浓度谷氨酸刺激的PC12细胞作为神经损伤抑郁的细胞模型,建立气相色谱-质谱联用(GC-MS)和UHPLC-Q/TOF-MS技术的细胞代谢组学方法,从细胞水平揭示栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁机制。(1)采用GC-MS技术对栀子豉汤保护谷氨酸致PC12细胞损伤的代谢轮廓进行分析。结合单变量和多元变量统计分析方法,推测与神经保护相关的抗抑郁差异代谢物,筛选出40个与栀子豉汤基于神经保护抗抑郁作用相关的差异代谢物;在Metaboanalyst网站上进行代谢通路的富集分析和拓扑分析,推测与神经保护相关的抗抑郁差异代谢通路。(2)采用UHPLC-Q/TOF-MS技术对栀子豉汤保护谷氨酸致PC12细胞损伤的代谢轮廓进行分析。结合单变量和多元变量统计分析方法,推测与神经保护相关的抗抑郁差异代谢物,筛选出49个与栀子豉汤基于神经保护抗抑郁作用相关的差异代谢物;在Metaboanalyst网站上进行代谢通路的富集分析和拓扑分析,推测栀子豉汤与神经保护相关的抗抑郁代谢通路。(3)比较两种质谱技术获得的差异代谢产物和抗抑郁代谢通路,结果表明栀子豉汤基于神经保护的抗抑郁作用与其改善细胞的能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢有关。三、采用CUMS刺激的大鼠作为神经损伤抑郁的动物模型,建立UHPLC-Q/TOF-MS技术的脑代谢组学方法,从动物水平揭示栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁机制。(1)采用CUMS联合单独饲养的方法建立神经损伤抑郁症的动物模型,通过比较模型组和给药组抑郁大鼠行为学实验结果,评价栀子豉汤基于神经保护作用的抗抑郁效果。结果表明栀子豉汤能显著增加大鼠糖水偏爱百分比,降低强迫游泳和悬尾的停止不动时间,具有显著抗抑郁作用。(2)采用基于UHPLC-Q/TOF-MS技术的代谢组学方法对抑郁大鼠的脑代谢轮廓进行分析,通过数据分析筛选出26个与栀子豉汤抗抑郁相关的差异代谢物。同样对其进行代谢通路分析发现,栀子豉汤基于神经保护的抗抑郁作用与其改善脑内的氨基酸代谢有关,包括谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、酪氨酸代谢和色氨酸代谢。四、比较栀子豉汤对谷氨酸致PC12细胞损伤和CUMS诱导抑郁大鼠的代谢组学结果,揭示神经损伤细胞模型和抑郁动物模型的相关性。对谷氨酸致PC12细胞损伤模型和CUMS诱导大鼠模型的代谢组学结果进行比较,结果表明两个模型中有10个共同的差异代谢物和5个共同的代谢通路,包括谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢和酪氨酸代谢。谷氨酸致PC12细胞损伤模型和CUMS诱导抑郁大鼠模型在抗抑郁作用效果及抗抑郁作用机制两方面相关性较好,互为补充,可为其他抗抑郁药物的作用机制研究提供参考。总之,本课题分别以谷氨酸损伤PC12细胞和CUMS刺激大鼠为神经损伤抑郁模型,从细胞水平和动物水平构建以基于代谢组学技术的整体代谢谱和生物标志物为新指标的综合药效评价体系,揭示了栀子豉汤基于神经保护的抗抑郁作用机制,明确了栀子豉汤抗抑郁药效物质基础。上述研究成果为其他抗抑郁中药复方的配伍机制研究提供了可借鉴的高通量筛选细胞模型,为栀子豉汤处方的二次开发和抗抑郁治疗提供理论依据,同时也为其他抗抑郁药物的作用机制研究提供技术借鉴。