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背景近几十年,肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)的发病率呈现增长态势,在泌尿生殖系统肿瘤发病率中仅次于膀胱癌,居第二位。目前,肾癌缺乏早期的诊断标志,晚期和转移后的肾细胞癌对放疗和化疗均不敏感。因此寻找更多具有临床应用价值的药物提高患者的生存率和生活质量是十分有意义的,也是RCC在分子免疫方面的研究热点之一。肿瘤的侵袭转移步骤复杂、环节众多,该过程中所涉及的分子机制为抑制其侵袭转移提供了靶点。上皮细胞-间充质转化(EMT)是指在特定的生理和病理情况下,上皮细胞在某些作用的驱动下,极性丧失,细胞间的相互作用力下降,细胞向具有更强运动能力的间质型细胞转化的。EMT在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演了重要角色,肿瘤细胞的EMT的程度直接决定了肿瘤的恶性程度。EMT最显著的特征是上皮标志物E-cadherin表达量下调,同时N-cadherin间质细胞标志蛋白和有关的转录因子表达上调。EMT可通过不同的信号通路如Notch、Wnt等通路激活,这些分子通路受到细胞内转录因子Snail和Slug的调控来诱导EMT的发生。因此,我们预测通过调控参与EMT发生过程的转录因子可以达到预防或抑制肿瘤细胞侵袭转移的目的。川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎,具有活血行气、祛风止痛、行气开郁等诸多功效。川芎嗪(Tetramethyipyrazine,TMP)是从川芎根茎中分离的药理活性成分之一,长期以来被广泛应用于预防和治疗缺血性脑中风和心血管疾病。除此之外,川芎嗪还具有对抗自由基,改善微循环等药理作用。越来越多的研究证实川芎嗪对肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤也具有一定的治疗作用。2013年,黄琦等通过实验研究发现川芎嗪可有效改善肾间质纤维化,其机制可能是川芎嗪通过抑制TGF-β1诱导的p-Smad2蛋白以及α-SMA蛋白表达的上调,从而抑制Smad2的活化,阻断上皮细胞间充质的转分化(EMT)。另有研究证实,川芎嗪可通过上调E-cadherin的表达水平,下调N-cadherin的蛋白表达,逆转EMT的过程,达到抑制肺癌细胞侵袭转移的治疗目的。鉴于此,我们试图以肾癌侵袭转移过程中的EMT机制为切入点,尝试探讨川芎嗪对肾癌细胞的作用及发挥抑制作用的分子机制,为临床抗肾癌药物的研究提供有价值的新靶点。目的研究川芎嗪对肾癌A498细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,并对川芎嗪发挥作用的分子机制做初步探讨。方法本课题分为三大部分。第一部分,川芎嗪对肾癌A498细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。采用MTT方法检测川芎嗪对A498细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术观察不同川芎嗪药物浓度组对A498细胞周期的影响;以平板克隆实验检测川芎嗪对A498细胞克隆能力的影响;以Trans-well细胞迁移实验观察川芎嗪对A498细胞迁移能力的作用;以Trans-well细胞侵袭实验观察川芎嗪对A498细胞侵袭能力的影响。第二部分,川芎嗪对裸鼠体内肾癌A498细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。首先我们将A498细胞接种至裸鼠皮下,构建裸鼠皮下荷瘤模型,通过与对照组比较观察川芎嗪对裸鼠皮下移植瘤增殖能力的影响;其次,我们采用裸鼠尾静脉注射A498细胞的方法建立A498细胞在肺内侵袭转移的动物模型,通过与对照组比较检测川芎嗪对A498细胞侵袭转移能力的影响。第三部分,川芎嗪对肾癌A498细胞发挥抑制作用的分子机制的研究。EMT在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演了重要角色,为了进一步探究川芎嗪对肾癌A498细胞发挥抑制作用的分子机制,我们通过Western blot方法检测川芎嗪对肾癌细胞EMT机制发生过程中N-cadherin、Snail和Slug三个标志蛋白表达的影响。结果在第一部分的实验中MTT法、流式细胞术、平板克隆实验结果表明川芎嗪可对A498细胞发挥抑制作用,该作用呈现时间和剂量依赖性;Trans-well细胞迁移和细胞侵袭实验结果显示川芎嗪可抑制A498细胞的迁移和侵袭作用,该作用同样呈现时间和剂量依赖性。第二部分,裸鼠皮下荷瘤实验结果显示川芎嗪药物处理组裸鼠皮下肿瘤生长速度慢于对照组,且肿瘤体积小于对照组,说明川芎嗪可抑制A498细胞在裸鼠皮下的肿瘤生长速度;在裸鼠体内转移瘤形成的实验中我们发现尾静脉注射对照组细胞组裸鼠100%形成了肺部转移瘤,川芎嗪处理组小鼠仅有37.5%形成肺部转移瘤,且肿瘤转移灶数量明显低于对照组,说明川芎嗪可抑制A498细胞在裸鼠体内的侵袭转移作用。第三部分,Western blot结果显示,与对照组相比,实验组各组N-cadherin、Snail和Slug蛋白的表达均受到了抑制,且随着药物浓度和时间的增加,抑制作用越明显。由此得出结论:川芎嗪可通过抑制N-cadherin、Snail和Slug三种蛋白的表达,对A498细胞EMT机制发挥抑制作用,从而抑制A498细胞的侵袭和转移能力。结论本研究体外细胞实验表明川芎嗪抑制肾透明细胞癌A498细胞的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力,说明川芎嗪可以抑制肾透明细胞癌的转移和形成远端病灶的能力。此外,在体内动物实验中通过裸鼠皮下种植瘤模型和尾静脉注射体内成瘤模型,我们发现川芎嗪小鼠给药处理后,可以明显的抑制裸鼠皮下成瘤及其体内转移的能力,结果同细胞实验一致。Western blot结果可知,随着给药浓度和时间的增加,川考嗪抑制了 N-cadherin、Snail和Slug的表达,抑制EMT发生从而抑制肾透明细胞癌的增殖、转移和形成远端病灶。