早孕因子（EPF）是参与妊娠过程中母体和胎儿之间复杂相互作用的重要免疫抑制反应因子。怀孕期的EPF促进妊娠早期胚胎的发育。妊娠相关糖蛋白（PAG）是妊娠期母体循环中重要的一种胎盘抗原,PAG的浓度异常也可以反应孕期胎盘胎儿的潜在危险。本实验室的前期研究也表明,牦牛血液中EPF和PAG水平变化与妊娠状态的吻合率分别为88%和82%。鉴于EPF和PAG具有对动物怀孕期间的胎盘功能及胎儿生存状态的指示作用,本研究初步选定其作为牦牛早期妊娠诊断的血液学指标,旨在建立一种牦牛妊娠早期高效快速诊断方法。试验采用RT-PCR方法进行EPF基因及PAG基因扩增;通过原核表达p ET28-His10-Sumo-EPF和p ET-28a-PAG重组蛋白。经诱导表达后用电洗脱的方式纯化重组PAG蛋白。用镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫动物制备抗体。分别用鼠源EPF多克隆抗体和兔源EPF多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右,PAG基因在1200 bp左右,两者大小皆符合预期,并通过测序验证获得重组阳性质粒。p ET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经诱导,表达分子质量大小为29 ku的蛋白（其中包括早孕因子目标蛋白和SUOM标签蛋白）,且在37℃、IPTG浓度为300 nmol·L-1、诱导6 h时获得最高表达量。p ET-28a-PAG重组质粒转化后经IPTG的诱导,表达分子质量大小为44 ku的蛋白,且在37℃、IPTG浓度为700 nmol·L-1、诱导6 h时获得最高表达量。Western blot及考马斯亮蓝染色结果显示,EPF蛋白在上清和包涵体中均有表达,PAG蛋白在包涵体中表达。用EPF免疫小鼠及兔后的抗血清皆能够与纯化的重组蛋白发生免疫反应。双抗体夹心ELISA检测方法建立的优化后条件为:捕获抗体稀释度为1:1600,检测抗体稀释度为1:3200;10%马血清在37℃下封闭60min;以OD450nm值≥0.2312作为阳性判定界限;该方法与PAG及孕酮无交叉反应,板内及板间变异系数分别在1.047%～8.003%、3.066%～9.406%之间,均小于10%,对EPF最低检测限度为11.77ng·L-1。本试验通过原核表达系统成功表达并纯化了牦牛EPF和PAG蛋白,制备了免疫原性较好的鼠抗和兔源EPF多克隆抗体。用EPF抗体建立了重复性好、特异性强、敏感性高的双抗体夹心ELISA检测方法。