论文部分内容阅读
生物柴油作为化石能源的替代燃料已在国际上得到广泛应用。至今生物柴油原料主要来自油料植物，但较高的原料成本限制了生物柴油的进一步推广。微藻作为高效光合生物有其特殊的原料成本优势。微藻生物柴油开发的关键是筛选到合适的高油微藻。大量研究表明，适合产业化的高油微藻必须具有以下特征：生长快、含油量高、适应能力强、易于采收、易于建立低成本的开放式培养。在众多微藻中，螺旋藻产业化最为成熟，生产快，培养条件简单，因此可以作为生物柴油原料的备选藻种。但是其蛋白含量高达60％以上，而脂类含量仅占细胞干重的3％左右。为了提高其脂类含量，我们试图通过基因工程手段对其代谢途径进行改造。
研究表明，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与植物含油量有着密切的关系。其间接控制了油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向，从而决定植物种子蛋白质/油脂含量比例。因此利用反义RNA技术抑制PEPC活性，有可能使代谢流更加充分地转向螺旋藻的脂肪代谢途径，从而获得高含油量的转基因螺旋藻。
本研究主要研究结果如下：
(1)克隆了钝顶螺旋藻869Spepc基因全长，并对其进行了生物信息学分析。结果表明，钝顶螺旋藻869Spepc基因全长为3108bp，多肽大小约为118kD，含有的主要氨基酸为Leu、Glu，其次为Arg、Ser;其属于原核型PEPC，一级结构高度保守，在二级结构上与高等植物极其相似。
(2)构建了反义pepc载体pEGFP-recA-p1（针对起始序列）和pEGFP-recA-p2（针对保守序列），并在大肠杆菌DH5α中进行了诱导表达。结果表明含pEGFP-recA-p2质粒的菌株与野生菌相比PEPC的酶比活力下降了约37%，总蛋白量减少了11.6%，总脂含量增加了4.5%，总蛋白/总脂含量比降低了约3倍。而含pEGFP-recA-p1质粒的菌株与野生菌相比均差别不大。这表明针对保守序列设计的反义RNA载体更具有通用性。
(3)对螺旋藻基因整合转化平台进行了改进，在转化载体上添加了GFP标签。利用超声转化法进行转化，成功地在螺旋藻中实现了GFP的持续表达。
(4)对螺旋藻转化筛选的培养抗性浓度进行了研究，结果表明，在液体培养时选用100μg/mLAmp和30μg/mLG418可以很好的抑制野生藻的生长，而在固体平板上则需要200μg/mLAmp和60μg/mLG418。
(5)通过抗性筛选和GFP荧光观察，采用微吸管分离法与多次超声处理相结合成功筛选到三株较纯的转化藻株，但是转化藻藻株在形态上与野生藻有很大区别。通过比对野生藻和转化藻荧光光谱学发现，转化藻藻株的藻胆体由于某种原因发生缺失，从而导致转化藻呈无色，生长缓慢，无法取得一定量的藻体以测定藻细胞油脂含量的变化。
总之，本研究虽然获得了转基因螺旋藻，但由于其生长受抑制，即使其油脂含量高也不适合进行将来的生物质能源开发。通过大肠杆菌的反义研究表明PEPC的抑制确实能提高其油脂含量，下一步的改进工作将围绕如何将反义基因导入螺旋藻染色体而不影响其生长，这需要选择更好的整合位点。本研究为构建富含油脂的转基因螺旋藻奠定了基础。