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cDNA—AFLP是一种使差异表达基因(转录水平)可视化的新技术,目前已广泛应用于植物遗传图谱和功能基因的研究,尤其用于筛选功能基因。以白桦雄花序为研究材料,优化并建立了白桦cDNA-AFLP体系,进而用此体系对白桦雄花发育早期和晚期差异表达基因进行分析。从得到的差异基因中筛选出白桦雄花发育早期的特异表达或早期表达量高的基因进行测序和初步的生物信息学分析。从早期表达的基因中选出4个相关基因进行实时定量PCR的检测,检测这4个基因在不同时期及不同部位中的表达情况,并进行基因功能的初步分析。主要研究结果如下:
1.优化并建立了白桦cDNA—AFLP体系,预扩增中Mg2+浓度为2mM,引物浓度为0.3μM,dNTP浓度为0.25mM,Taq酶浓度为1U,退火温度控制在60℃时,预扩增的效果好。
2.在白桦雄花早期、晚期花发育的基因表达谱中,总共显示约7000个条带,有858条是差异表达的,其中350个在发育早期特异表达或表达量明显大于晚期,548个在发育晚期特异表达或表达量明显大于早期。筛选出白桦雄花早期表达信号强、重复性好的200个条带进行回收、克隆、测序。通过比对,有74个片段与已知的基因有相似性,其余片段均是未知功能片段。没有比对上的序列占了很大的比例,可能是组织特异性表达,或者因为片段太短,有可能片段位于5ˋ或3ˋ-UTR区域,不编码蛋白,在蛋白水平上没有功能。
3.筛选获得的74条EST序列被GenBank的dbEST数据库收录,收录号为HS107072-HS107145。通过BlastX对EST进行功能注释,并对其进行功能分类,EST功能涉及了代谢、细胞组分、生长和发育等途径。注释的EST序列都与已知花发育早期相关的基因有很高的同源性。这些EST的获得为白桦雄花发育相关基因克隆和功能解析奠定了基础。
4.从筛选的74个白桦雄花早期花发育的基因中,选出4个基因,即:β-酮酰辅酶A合成酶基因、乙醇脱氢酶基因、β-酮酰.ACP合成酶基因和双极驱动蛋白基因。以actin(肌动蛋白基因)为内参基因,用实时定量PCR分析4个基因的表达。结果表明,4个基因在雄花发育不同时期及不同部位的表达程度不同,并根据4个基因的表达模式对其在花发育过程中可能参与的功能做了初步分析。