病毒性出血热(Viral hemorrhagic fevers, VHFs)是一组临床症状以发热常伴出血为主要特征的急性病毒性传染病,早期临床表现无特异性,出血可发生在皮下、内脏、体腔等部位,可出现休克,多器官衰竭,临床过程凶险,病死率高,最高可达90%。随着经济全球化进程的不断深入,人员和物资交流日渐频繁,媒介分布的地理界限被不断打破,输入引发的疫情暴发的风险显著增加。且随着全球变暖,生态环境遭到不同程度的破坏,新发传染病和新病毒也不断被发现。建立快速、灵敏特异、高通量的出血热病毒实验室检测方法并及时对毒株进行测序对临床诊治及流行病学疫情调查具有重要意义。本研究就快速准确高通量检测出血热病毒展开初步研究。一、基于磁珠法的出血热病毒核酸纯化富集方法的研究在对样本进行基于随机扩增等非特异扩增的检测或是测序的过程中,常常会因为样本中非目的核酸即背景核酸含量过高而影响检测及测序效果。非特异扩增前对样本进行纯化富集,会降低样本中背景噪音,使检测结果更为灵敏准确。出于此目的,对样本进行前期处理,即基于磁珠法的出血热病毒核酸纯化富集方法的研究。本研究分别以黄病毒属,汉坦病毒属,白蛉病毒属中的毒株为研究对象,比对各属基因组保守区,并设计出特异性杂交探针,进行5’端生物素修饰,将其与链霉亲和素修饰磁珠共价结合,以纯化样本中各属内出血热病毒核酸。并通过比较特异性纯化前后样本中有效核酸成分所占比例的大小及二代测序中有效reads数来比较纯化富集效果。结果显示三个属的特异性杂交探针能够很好捕获各属中出血热病毒。毒株模拟样本结果显示黄病毒属中登革病毒四个亚型纯化后相较于纯化前样本中有效核酸质量比例的比值分别为2.3,2.6,2.4,8.3；黄病毒纯化后相较于纯化前有效成分比例的比值为8.5；汉坦病毒属汉滩病毒,汉城病毒,普马拉病毒纯化后相较于纯化前有效核酸成分比例的比值分别为1.5,4.0,1.9；同理白蛉病毒属中SFTSV纯化后相较于纯化前有效成分比例的比值为1.5。故纯化后的有效核酸成分相较于纯化前的核酸有效成分比例的比值均大于1。且二代测序中,cDNA文库制备时有效数据比例全转录组扩增(WTA)前或后进行特异性富集纯化均较不开展富集纯化有显著改善,有效数据比例分别为5.57%,6.39%,2.71%,差别具有显著性(χ2=9799.8,P<0.001)。对WTA前或后进行特异性富集纯化对测序结果有效数据影响进行比较分析时发现,扩增后进行纯化优于扩增前(P<0.001)。在三个病毒含量不等的SFTSV临床血清样本的测量中,病毒含量较高的17号样本(CT值=20),特异性探针纯化的样本相较于不纯化样本有效数据的比例高达74.42%,50.9%,且WTA前纯化处理效果更好一些。而在病毒含量相对较低的27,36号临床样本中,纯化处理的样本虽较不纯化样本有效数据的比例有一定的提高,但是由于本身样本中目的核酸含量比较低,故纯化处理过程中在降低背景核酸的同时,目的核酸也会遭到不同程度的损失,故效果不是很明显。且含量相对较低的样本WTA后对其进行纯化富集效果较好。综上可知基于核酸杂交的病毒基因组特异性富集纯化方法可成功捕捉到属内病毒,提高核酸有效成分的含量,降低无义核酸成分即样本背景,有效降低二代测序中背景值,提高测序效率,进而起到纯化富集的作用。二、随机PCR扩增与液相悬浮芯片技术相结合的出血热病毒高通量检测技术研究为更好的应对突发疫情病原体的检测,快速准确高通量对病原体进行检测筛查显得尤为重要。本研究将随机PCR与tem-PCR相结合对样本进行非特异扩增,进而应用悬浮芯片技术对产物进行高通量的检测。该方法打破依赖特异性引物扩增特异性核酸片段的局限,其对模板核酸进行随机扩增,进而在扩增出的大量的大小不等,浓度不等的核酸片段中应用特异性检测探针去捕捉检测扩增出的片段。进而提高一次性检测病毒的数量,理论上一次能够同时对100种不同的病原体进行检测,大大减少筛查时间,提高检测效率。为缩短应对突发病例及疫情的处置时间提供实验室检测技术。结果显示在扩增中存在较强非特异交叉反应,仍需进一步优化研究。