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胶质瘤是颅内最常见的原发性脑肿瘤,在颅内肿瘤中其所占比例约为40~43%,国内外有关胶质瘤的临床治疗效果差,近30年内并没有明显的改进恶性胶质瘤高复发率和低治愈率的难题。脑胶质瘤的特征主要有:肿瘤细胞快速增殖、肿瘤细胞侵袭性生长和肿瘤易复发。高度恶性的胶质瘤中位生存期较短,仅有14-16个月。胶质瘤在本质上是一类基因的异常表达的疾病,包含过表达的癌基因、突变或缺失的抑癌基因以及信号通路发生异常改变等环节。手术治疗、手术后同步放化疗及后期辅助化疗效果较差,术后行同步放化疗及后期辅助化疗又可能对中枢神经系统产生毒、副作用。因而,胶质瘤的临床治疗目前仍是难点。所以,从本质上研究胶质瘤基因异常的基因治疗已经成为神经外科领域的热点。microRNAs(miRNAs)是由19-25个核苷酸(nts)组成的一内源性非编码RNA。成熟miRNAs可与靶基因的3’UTR非转录区域通过采用不完全或着完全互补的特异性配对方式,对靶基因的表达程度进行调控。miRNAs通常调控一组或多个具备类似功能的基因。这样miRNAs在应用于靶向基因治疗时明显优于目前基因治疗过程中经常应用的靶向单个基因治疗手段。研究数据表明miRNA能够通过调节与其特异性结合的靶基因参与的信号通路调节肿瘤的发生、发展,从而起到抑癌基因或癌基因的作用,推动了肿瘤恶性生物学行为,同时对肿瘤的发生、发展和预后起了决定性的作用。胶质瘤中各种不同类型的miRNA主要是通过下调或着上调肿瘤细胞的miRNA的表达,从而抑制其增殖或者影响其迁移侵袭或诱导肿瘤细胞凋亡。所以,在胶质瘤细胞中对miRNA表达调控的研究可能成为胶质瘤的诊断和治疗的新研究方向。研究数据表明异常表达的miR-451在脑胶质瘤、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌和胃癌中均有相关研究报道。miR-451和脑胶质瘤的恶性生物学行为有着密切联系。miR-451可以抑制胶质瘤的侵袭和转移,发挥着抑癌基因的作用,但其确切的相关调控机制目前还不清楚。本实验的前期研究显示miR-451在抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移方面扮演着重要角色,但miR-451通过哪条信号通路起到抑制胶质瘤的侵袭和迁移作用尚未阐述。通过生物信息学分析,我们发现miR-451可能靶基因IKK-β。IKK基因的活化是调控NF-кB基因表达的重要环节。研究数据表明在恶性胶质细胞瘤发生的早期NF-кB基因就已经有了较高的表达,NF-кB信号通路的调控目前已是研究治疗恶性胶质细胞瘤的重要实验方向。本课题应用miR-451拟似物(miR-451 mimics)以及构建的慢病毒miRNA-451应用在胶质瘤细胞株上,拟利用荧光素酶实验证实IKK-β是miR-451的直接靶基因;体内、外实验研究miR-451通过靶标IKK-β调控NF-кB/Snail信号通路抑制胶质瘤侵袭和迁移的分子机制,从而为miR-451靶向治疗胶质瘤提供新线索,为胶质瘤临床医治提供新的方向。本课题研究共分以下三部分:第一部分中应用荧光素酶实验研究胶质瘤中miR-451对IKK-β基因的调控关系。含有IKK-β结合位点及突变位点荧光素酶报告质粒的获得:将IKK-β的结合位点(Binding sites)以及结合位点突变后的序列克隆到p GL3报告质粒中,测序验证方向和序列的正确性。LN229、U251和U87胶质瘤细胞共转染p GL3-IKK-β3’UTR-Wild/Mut和miR-451mimics。结果显示:IKK-β与miR-451的3’UTR区可以相互结合,上调miR-451表达后野生型IKK-β荧光素酶活性显著降低,表明在胶质瘤细胞中IKK-β基因是miR-451的直接靶点。第二部分中通过体外实验研究miR-451通过靶标IKK-β调控NF-кB/Snail信号通路抑制胶质瘤侵袭和迁移的作用。在LN229、U251和U87细胞株和miR-451过表达的LN229、U251和U87细胞株中,运用实时定量PCR检测miR-451在m RNA基因水平对IKK-β调控的影响。利用划痕实验和Transwell试验,检测miR-451敲低IKK-β后LN229、U251和U87细胞的侵袭和迁移能力变化。结果显示:miR-451通过靶标IKK-β抑制NF-кB/Snail信号通路的活性;IKK-β、NF-кB(p50、p65)、Snail基因编码蛋白明显下降;应用划痕试验、Matrigel的Transwell实验检测,结果表明miR-451敲低IKK-β后的LN229、U251和U87细胞的侵袭和迁移能力明显下降。第三部分中通过体内研究miR-451通过靶标IKK-β调控NF-кB/Snail信号通路抑制胶质瘤侵袭和迁移的作用。通过立体定向颅内注射的方式制备了裸鼠胶质瘤颅内模型并进行相关对的体内实验研究。将裸鼠根据立体定向颅内注射治疗药物的不同随机化的分为空白对照组(Black control)、慢病毒miRNA阴性对照组(LV-miRNA-NC)和慢病毒miRNA-451组(LV-miRNA-451),并进行裸鼠活体成像。记录三个实验分组中各只裸鼠的三个实验分组中各只裸鼠的体重及变化、利用裸鼠活体成像的方法来检测颅内肿瘤的荧光强度,观察并登记三个实验分组中每只裸鼠具体的死亡日期,并将其绘制成生存曲线,应用统计方法中的Kaplan-Meier法进行三个实验分组裸鼠的生存分析。最后将三个实验组各只死去的裸鼠的脑组织行HE染色和免疫组化染色。体内实验结果显示,Black control组和LV-miRNA-NC组相比,LV-miRNA-451组裸鼠体内荧光强度较弱,且生存期显著长。免疫组化提示LV-miRNA-451组中IKK-β/NF-кB/Snail通路中的成员IKK-β、NF-кB(p50、p65)、Snail的表达均下降。上述结果充分验证了胶质瘤中miR-451通过靶标IKK-β调控NF-кB/Snail信号通路抑制胶质瘤侵袭和迁移的能力。结论:1.IKK-β为胶质瘤中miR-451的直接靶基因。2.以慢病毒为载体将LV-miRNA-451转染胶质瘤细胞后,胶质瘤细胞内的miR-451可稳定持续的表达。3.体内、外实验表明:miR-451通过靶标IKK-β调控NF-кB/Snail信号通路蛋白的表达,降低了细胞侵袭和迁移调节因子NF-кB(p50、p65)和Snail基因的表达水平,显著的抑制了胶质瘤细胞的侵袭和迁移。4.miR-451是一个抑癌基因,是潜在胶质瘤基因治疗的侯选靶点。