柿果属于跃变型果实,采收后极易软化,给柿果的贮藏运输带来不便。大量研究证实,乙烯是跃变型成熟果实的催熟剂。跃变型果实中自我催化的乙烯合成反应启始后,合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生物合成,可以降低果实乙烯的含量。而乙烯只能与受体结合后才能启动一系列的信号转导过程,完成果实完熟过程。本研究以柿叶片为材料,克隆分离了ETR5基因,成功构建了干扰表达载体,结果如下:1.利用Rneasy^?Plant Mini Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA,RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为2.0896,为mRNA的反转录奠定了基础。2.mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(Omniscript^TMRT Kit),分离到完整性好的mRNA,为继后的RT-PCR提供可靠保证。3.根据已发表的植物ETR保守氨基酸序列,设计了一对特异性引物,进行RT-PCR扩增,得到一个长549bp的片段,经序列分析证明该片段具有的保守区氨基酸序列。4.通过分析已获得ETR5基因片段,用PCR法去除内含子,并将得到的片段转化到大肠杆菌中经过鉴定及测序,证明去除内含子的基因片段。5.设计两对特异性引物分别含有酶切位点XbaⅠ和SacⅠ、SmaⅠ和SacⅠ,用PCR法将酶切位点克隆到ETR5基因序列上。6.得到两条长度不同且分别含有XbaⅠ和SacⅠ、SmaⅠ和SacⅠ酶切位点的扩增产物后,以限制性内切酶SacⅠ分别消化后,用T4 DNA连接酶将酶切大片段连接,并转化到大肠杆菌DH5α中。7.用XbaⅠ和SmaⅠ分别酶切含有ETR5基因的质粒和pSMAK311质粒,将ETR5基因插入到含有CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中,构建成RNAi植物表达载体pSMAK-ETR5-RNAi。8.利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA101中,经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌中。