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肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs）被广泛认为是肿瘤形成的“种子”细胞，在肿瘤发生、维持、转移与复发过程中均发挥着关键性作用。针对肿瘤干细胞进行靶向治疗是未来肿瘤治疗最有效的策略之一，为肿瘤治疗指出了新方向。然而，肿瘤干细胞数量稀少，分离及纯化较难，成为肿瘤干细胞研究的关键性技术瓶颈问题。因此，建立一套有效分离并鉴定肿瘤干细胞的技术体系，对肿瘤研究和治疗具有十分重要的价值。鉴于此，本研究以人源性多形性胶质母细胞瘤U251细胞系为主要研究对象，成功建立一套有效富集、分离肿瘤干细胞的超顺磁性纳米颗粒分离体系；并进一步分析超顺磁性纳米颗粒对肿瘤干细胞生物学特性的影响，为超顺磁性纳米颗粒在肿瘤干细胞分离纯化、肿瘤诊断与靶向治疗等方面的应用提供理论基础。通过上述研究工作，我们取得了以下重要结论：1.采用无血清悬浮培养联合细胞周期特异性药物长春新碱（vincristine, VCR）富集分离多形性胶质母细胞瘤U251细胞系中的肿瘤干细胞，结果表明该方法能够有效富集肿瘤干细胞。富集分离的肿瘤干细胞能够连续传代，具有良好的自我更新能力。MTT分析及FDA/PI荧光双染结果显示VCR诱导富集得到的肿瘤干细胞增殖能力旺盛、细胞活性好；RT-PCR以及免疫细胞化学染色结果显示肿瘤干细胞表面标志物CD133和神经巢蛋白（nestin）呈强阳性表达；胶质瘤球具有多向分化能力，能够分化为以胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标志物的星形细胞、髓鞘脂碱性蛋白（MBP）为标志物的少突胶质细胞以及微管相关蛋白（MAP2和tau）为标志物的神经元；RT-PCR分析表明富集分离的肿瘤干细胞高表达多药耐药蛋白1（MRP1）基因和凋亡抑制基因survivin。因此，此种方法富集分离的肿瘤干细胞可以用于开展后续试验。2.研究超顺磁性纳米颗粒标记对肿瘤干细胞生物学特性的影响。研究了多聚赖氨酸（Poly-L-lysine, PLL）修饰的γ-Fe2O3纳米颗粒标记肿瘤干细胞对其细胞活性和增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能、细胞周期分布与细胞凋亡等生物学性能的潜在影响。我们首先利用部分还原共沉淀法制备出超顺磁性γ-Fe2O3纳米颗粒，并将阳离子转染剂PLL修饰于γ-Fe2O3纳米颗粒表面以加强细胞对纳米颗粒的吸收；然后利用PLL修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记来源于胶质瘤细胞系U251的肿瘤干细胞。普鲁士蓝染色及原子吸收分光光度计分析结果表明PLL修饰γ-Fe2O3纳米颗粒成功标记肿瘤干细胞；FDA/PI荧光双染及MTT分析结果表明磁标记不影响肿瘤干细胞及其分化细胞的活性和增殖能力；免疫细胞化学染色及半定量RT-PCR分析结果表明磁标记不影响肿瘤干细胞标志物表达及其多向分化潜能；并且磁标记后形成的胶质瘤球能传代形成新的胶质瘤球，表明磁标记肿瘤干细胞具有自我更新能力。此外，流式细胞仪分析结果表明与未标记对照相比磁标记对肿瘤干细胞及其分化细胞的细胞周期分布（S期细胞为15.93%vs15.44%&11.35%vs11.31%）基本没有影响；流式细胞仪分析磁标记细胞及其分化细胞的早期凋亡率分别为4.4%和1.4%，与对照相比（4.9%和1.1%）基本没有影响。以上这些研究结果为超顺磁性纳米颗粒在肿瘤干细胞分离、细胞基的治疗以及利用磁共振成像技术非侵袭性的捕获肿瘤干细胞体内行为等方面的应用提供了理论基础。3.利用超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的类酶活性特征调控肿瘤干细胞的增殖。通过Fe3O4纳米颗粒的类辣根过氧化物酶（HRP）活性可以调控肿瘤干细胞自身活性氧（ROS）的产生水平，从而能够调控肿瘤干细胞的增殖。研究结果表明，PLL修饰不影响Fe3O4纳米颗粒的类过氧化物酶活性。PLL-Fe3O4纳米颗粒复合物通过降低肿瘤干细胞内源性ROS水平，从而促进了其增殖及细胞周期进程；PLL-Fe3O4纳米颗粒复合物处理的肿瘤干细胞过氧化氢酶活性显著升高。此外，PLL-Fe3O4纳米颗粒复合物不影响肿瘤干细胞标志物表达、多向分化能力以及actin细胞骨架结构与形态。与前人研究不同，本研究报道的是Fe3O4纳米颗粒对细胞生长的有利影响，从而为Fe3O4纳米颗粒在生物医药领域潜在的广泛应用提供有力证据。4.利用改进的高温乳化法制备出超顺磁性HSA/γ-Fe2O3微珠，然后以蛋白微珠HSA/γ-Fe2O3为载体材料，通过亲和素-生物素的桥联作用将蛋白微珠与特异性捕获抗体（抗-CD133单克隆抗体）偶联制得免疫磁珠（immunomagnetic beads, IMBs），利用制得的IMBs进一步分离纯化肿瘤干细胞。结果表明我们成功制备了活性较高的IMBs，并且利用制得的IMBs成功实现了靶细胞即CD133+细胞的分离纯化。该分离体系在40min内就能实现CD133+细胞的分离。所分选的CD133+细胞具有良好的细胞活性、能够增殖形成胶质瘤球，免疫染色结果表明增殖形成的肿瘤球高表达肿瘤干细胞标志物CD133和nestin，且增殖形成的胶质瘤球具有多向分化能力。综上所述，我们成功建立了一种无血清悬浮培养联合细胞周期特异性药物VCR有效富集分离肿瘤干细胞的方法；并深入研究了超顺磁性纳米颗粒标记对肿瘤干细胞生物学特性的影响，进而为磁性纳米颗粒在肿瘤干细胞研究领域中的应用奠定了理论基础。此外，我们深入分析了Fe3O4纳米颗粒的过氧化物酶类酶活性对肿瘤干细胞增殖的调控作用；并建立了一种基于超顺磁性蛋白微珠的肿瘤干细胞高效分离与纯化技术体系，该体系不仅可以用于U251细胞系中肿瘤干细胞的分离与纯化，还可以用于其它肿瘤组织或细胞系中靶细胞的分离与纯化。