研究背景:在世界范围内,乳腺癌是公认的女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率逐年攀升,严重威胁全球女性的身心健康。乳腺癌是一种形态学和遗传学高度异质性的疾病,异质性一方面已成为评估和治疗乳腺癌的主要阻碍,另一方面也推动了基于分子分型的乳腺癌个体化治疗。结合基因表达谱分析,乳腺癌目前主要可以分为3种亚型:激素受体阳性/ERBB2阴性(约70%),ERBB2阳性(约15%～20%)和三阴性(Triple Negative Breast Cancer,TNBC;激素受体及 ERBB2均阴性;约15%)。TNBC患者具有发病年龄轻、恶性程度高、复发转移早、临床预后差的特点,而且由于TNBC患者缺少上述受体的表达,相对于其他患者而言,不能从针对激素受体阳性患者的内分泌治疗及抗ERBB2的靶向治疗中获益。目前化疗是TNBC的主要辅助治疗手段,但仅有20%的TNBC患者对标准化疗方案具有敏感性,且相当一部分患者会出现化疗耐药;化疗耐药后更易发生远处转移而表现为预后不良。TNBC的进展转移是乳腺肿瘤学界持续关注的焦点,阐明其分子机制将对提升治疗效果、改善临床预后具有非常重要的意义。TNBC的进展转移是一个多基因参与、受到表观遗传学调控的多维度的生物学过程。大量研究结果显示,非编码RNA(non-coding RNA)的异常表达在恶性肿瘤的表观遗传学调控方面起到了至关重要的作用。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)作为非编码RNA中的重要组成部分,已经成为癌症研究的前沿研究领域。LncRNA是一类长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt),不具有蛋白质编码功能的RNA转录本的总称;其在转录组中占据了极大的比例,包含了增强子RNA,snoRNA宿主,基因间转录本和与其他基因重叠的转录本,正义或反义转录本等。从细胞定位的角度看,定位在细胞质中的LncRNA主要起内源性microRNA海绵的作用,以竞争性结合靶基因;而定位在细胞核中的LncRNA则充当蛋白-蛋白相互作用的支架,蛋白-DNA相互作用和染色质修饰的脚手架。从LncRNA与其靶基因在基因组位置的角度来看,LncRNA可能在邻近基因通过顺式(in cis)作用,而在远距基因中通过反式(intrans)作用进行表达调控。不到十年前,strand-specific高通量测序的出现证明了某些LncRNA是蛋白质编码基因的自然反义转录产物。近一半的蛋白编码基因具有特异的反义LncRNA(antisense LncRNA,asLncRNA),因此经常观察到 asLncRNA 通过顺式或反式作用调控正义编码基因。因此,沉默asLncRNAs可能是干预致癌驱动基因的潜在切入点。为了寻找与TNBC进展转移密切相关的LncRNAs,我们对人类基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因表达综合库(Gene Expression Omnibus,GEO)进行深入挖掘,选取了在TNBC中高表达的NAMPT-AS(NAMPT-antisense,NAMPT-AS)作为目标 LncRNA。结合对 ENCODE 数据库(Encyclopedia of DNA Elements database,ENCODE),FANTOM5(Function Annotation Of The Mammalian Genome,FATOM)项目所得结果的生物信息学分析,通过体内和体外实验,临床标本对NAMPT-AS的功能和作用机制进行了深入的研究。研究方法及结果:在本课题中,我们拟进一步深入研究NAMPT-AS在TNBC的进展转移的过程中的作用,具体内容包括以下四个部分:第一部分 乳腺癌中NAMPT-AS的表达分析研究研究方法1.与TNBC进展转移相关LncRNA的筛选1.1通过TCGA数据库,GEO数据库,齐鲁医院乳腺癌样本库分析TNBC及非TNBC中LncRNA的表达谱;1.2利用GEO数据库分析TNBC及正常样本中NAMPT-AS的表达量,利用qPCR技术检测各类乳腺癌及正常乳腺细胞系中NAMPT-AS的表达量;研究结果1.筛选得到TNBC中高表达的NAMPT-AS1.1基于TCGA数据库、GEO数据库、齐鲁医院乳腺癌样本库的分析结果显示,NAMPT-AS在TNBC中的表达量明显高于非TNBC及正常乳腺组织;1.2 qPCR定量显示在TNBC细胞系中NAMPT-AS的表达量明显高于其他亚型的乳腺癌及正常乳腺细胞系。第二部分NAMPT-AS调控NAMPT的分子机制的研究研究方法1.生物信息学分析NAMPT-AS参与调控的信号通路1.1利用二代RNA-Seq方法对干扰了 NAMPT-AS的MDA-MB-468细胞系进行测序分析;1.2利用单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)荧光染色及免疫荧光染色的方法对LC3的表达量进行检测;利用电镜观察细胞内自噬囊泡;利用Western Blot检测mTOR信号通路相关分子的变化。2.NAMPT-AS在细胞内的定位2.1利用生物学信息学预测、核质分离及RNA-FISH的方法对NAMPT-AS定位;3.NAMPT-AS对NAMPT的转录调控3.1利用双荧光素酶报告基因(Dual luciferase reporter gene assay)检测NAMPT-AS过表达情况下NAMPT的转录水平;3.2通过生物信息学预测能够与NAMPT-AS结合的转录因子,应用双荧光素酶报告基因、RIP、ChIP等实验验证该转录因子可以被招募到NAMPT的启动子区并与NAMPT-AS结合;3.3利用ENCODE数据库分析ChIP-Seq数据,ChIP实验及双荧光素酶报告基因实验证明NAMPT的启动子区具有双向转录的功能。4.NAMPT-AS下游microRNA的预测和验证4.1 通过数据库 Microcosm,Targetscan,RegRNA,SegalLab 预测 NAMPT-AS下游、NAMPT上游的microRNA靶标并取交集;通过RNA二级结构及结合能分析NAMPT-AS与目标microRNA结合的可能性;4.2通过qPCR的方法检测NAMPT-AS与目标microRNA之间的相互调控;5.分子生物学实验验证目标microRNA与NAMPT-AS的结合5.1构建包含野生型和突变型的NAMPT-AS可能结合位点的pmirGLO载体,利用双荧光素酶报告基因实验验证结合关系;5.2通过RIP实验验证NAMPT-AS,目标microRNA能够同时与RISCs复合体的关键蛋白AGO2结合;6.目标MicroRNA与靶基因NAMPT结合的预测与验证6.1 数据库 DIANA,Targetscan,miRWalk,miRDB 预测目标 microRNA 的靶基因并取交集;Western Blot验证目标microRNA对靶基因的调控;6.2将靶基因的3’UTR区构建入pmirGLO载体中,通过双荧光素酶报告基因、RIP验证靶基因与目标microRNA的结合。研究结果1.NAMPT-AS通过mTOR信号通路影响自噬表型RNA-Seq显示NAMPT-AS与mTOR信号通路相关,并通过Western Blot、MDC、免疫荧光LC3染色及电镜观察均显示NAMPT-AS与自噬表型密切相关;2.NAMPT-AS招募转录因子POU2F2至启动子区调控NAMPT的转录2.1根据LncAtlas的生物信息学预测、核质分离及RNA-FISH实验均证明NAMPT-AS在细胞质和细胞核均有分布;2.2 NAMPT-AS通过招募转录因子POU2F2促进NAMPT-AS和NAMPT的转录2.2.1 双荧光素酶报告基因实验证明NAMPT-AS可以促进NAMPT的转录;2.2.2 生物信息学方法预测发现NAMPT-AS可以与转录因子POU2F2结合,干扰POU2F2的表达后发现NAMPT-AS与NAMPT的表达均降低;双荧光素酶报告基因实验证明POU2F2可以结合到NAMPT的启动子区,并可以促进NAMPT-AS和NAMPT的转录;RIP实验证明POU2F2可以与NAMPT-AS 结合;2.3 NAMPT启动子区具有双向转录的能力2.3.1 ChIP 实验证明 NAMPT 的启动子区存在 POU2F2,RNA Polymerase Ⅱ,H3K4me3,H3K27ac的富集;基于ENCODE数据库的ChIP-Seq数据分析进一步证明NAMPT的启动子区存在RNA Polymerase Ⅱ,H3K4me3,H3K27ac的富集;2.3.2 双荧光素酶报告基因实验证明在非处理条件下,NAMPT的启动子区具备双向转录的能力;3.NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT 信号通路的解析3.1 NAMPT-AS下游的目标miR-548b-3p的预测与验证3.1.1 经 Microcosm,Targetscan,RegRNA,SegalLab 四个数据库预测并取交集得到位于NAMPT-AS下游、NAMPT上游的miR-548b-3p;3.1.2 RNA结合能分析显示NAMPT-AS与miR-548b-3p有较强的结合可能性;3.1.3 qPCR检测示干扰NAMPT-AS后miR-548b-3p表达升高;过表达miR-548b-3p 后,NAMPT-AS 的表达下降;3.2分子生物学实验验证口标microRNA与NAMPT-AS的结合3.2.1 双荧光素酶报告基因实验证明,miR-548b-3p与NAMPT-AS野生型结合区结合,与突变型NAMPT-AS的结合区不结合;3.2.2 RIP实验证明NAMPT-AS,miR-548b-3p能够同时与RISCs复合体的关键蛋白AG02结合;3.3 miR-548b-3p与NAMPT结合的预测和验证3.3.1 DIANA,Targetscan,miRWalk,miRDB 数据库预测 miR-548b-3p 的靶基因并取交集,确定靶基因为NAMPT;3.3.2 Western Blot证明过表达miR-548b-3p可以降低NAMPT的蛋白表达;3.3.3 双荧光素酶报告基因实验证明,miR-548b-3p与NAMPT野生型3’UTR结合区结合,与突变型NAMPT的结合区不结合;RIP实验证明NAMPT,miR-548b-3p能够同时与RISCs复合体的关键蛋白AG02结合。第三部分NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT的功能研究研究方法1.NAMPT-AS的体外功能分析1.1利用MTT、流式细胞术、克隆形成及Transwell实验分析分别干扰和过表达NAMPT-AS后,细胞的增殖、凋亡及浸润转移情况;1.2利用Western Blot实验分析细胞增殖、凋亡有关蛋白的表达情况;2.利用数据库分析目标miR-548b-3p与患者OS的关系3.miR-548b-3p的生物学功能分析3.1利用MTT、克隆形成、流式细胞术探索miR-548b-3p对细胞增殖、凋亡、浸润转移能力的影响;3.2利用MDC染色、免疫荧光LC3染色、Western Blot探索miR-548b-3p对于细胞自噬表型及信号通路的影响;4.NAMPT的生物学功能分析4.1 利用MTT、克隆形成、Transwell实验探索NAMPT对于细胞增殖和浸润转移能力的影响;4.2 利用MDC染色、免疫荧光LC3染色、Western Blot探索NAMPT对于细胞自噬及mTOR信号通路的影响;4.3 Rescue实验:观察mTOR抑制剂雷帕霉素作用下,过表达NAMPT对于mTOR信号通路及自噬关键蛋白表达的调控;通过Western Blot检测mTOR信号通路及自噬关键蛋白的表达,观察mTOR抑制剂雷帕霉素是否与干扰NAMPT具有协同作用。5.体内荷瘤及肺转移实验验证NAMPT-AS对于TNBC增殖和转移的影响5.1 构建NAMPT-AS过表达的MDA-MB-231稳筛细胞系并进行皮下注射,定期记录肿瘤体积变化及终点时肿瘤重量的差异;5.2对NAMPT-AS过表达组和对照组的肿瘤组织提取RNA和蛋白,qPCR检测NAMPT-AS和NAMPT的表达量,及mTOR信号通路及自噬关键蛋白的表达情况;5.3尾静脉注射NAMPT-AS过表达稳筛细胞系和对照组细胞系,观察裸鼠肺转移情况;6.体内荷瘤实验验证NAMPT对于TNBC细胞增殖的影响构建NAMPT稳定干扰的MDA-MB-231细胞系并进行皮下荷瘤注射,定期记录肿瘤体积变化及终点时肿瘤重量的差异。研究结果1.NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT 功能的体外实验1.1 NAMPT-AS高表达促进增殖和浸润转移、抑制凋亡1.1.1 MTT、克隆形成、流式细胞术和Transwell实验显示NAMPT-AS过表达促进细胞的增殖侵袭,干扰后会抑制细胞的增殖侵袭;1.1.2 Western Blot及流式显示NAMPT-AS干扰会促进细胞的凋亡;1.2 miR-548b-3p的生物学功能分析1.2.1 miR-548b-3p高表达与患者OS预后良好密切相关1.2.2 MTT、克隆形成、流式细胞术证明过表达miR-548b-3p可以抑制细胞的增殖、促进凋亡;1.2.3 Transwell实验证明过表达miR-548b-3p抑制细胞的浸润转移能力;过表达miR-548b-3p可以部分逆转NAMPT-AS对细胞浸润转移的促进作用;1.2.4 MDC、免疫荧光LC3染色、Western Blot实验显示过表达miR-548b-3p促进细胞的自噬表型、抑制mTOR信号通路的激活并升高自噬关键蛋白的表达;1.3 NAMPT的生物学功能分析1.3.1 MTT、克隆形成、Transwell实验证明NAMPT促进细胞增殖和浸润转移;1.3.2 MDC染色、免疫荧光LC3染色、Western Blot证明干扰NAMPT可以促进细胞自噬、抑制mTOR信号通路、促进自噬关键蛋白的表达;1.3.3 Rescue实验:mTOR抑制剂雷帕霉素作用下,过表达NAMPT可以部分逆转雷帕霉素对于mTOR信号通路的抑制及自噬关键蛋白表达的激活作用;Western Blot示mTOR抑制剂雷帕霉素可以与干扰NAMPT协同抑制mTOR信号通路并促进自噬关键蛋白的表达;2.NAMPT-AS//NAMPT功能的体内实验2.1 体内实验证明NAMPT-AS促进肿瘤的增殖和转移2.1.1 皮下荷瘤实验证明NAMPT-AS过表达组肿瘤体积和质量明显大于对照组;2.1.2 NAMPT-AS过表达组肿瘤组织NAMPT-AS及NAMPT的表达量明显高于对照组;Western Blot示NAMPT-AS过表达组mTOR信号通路相关蛋白处于激活状态;2.1.3 NAMPT-AS过表达组肺转移结节数目明显多于对照组;2.2体内皮下荷瘤实验证明NAMPT过表达组肿瘤的体积和质量明显大于对照组。第四部分NAMPT-AS/NAMPT的临床预后价值研究方法1.NAMPT-AS与TNBC进展转移的关系1.1通过TCGA数据库、齐鲁医院标本库收集的乳腺癌样本及对应患者的临床预后信息确立NAMPT-AS的表达量与总体生存(Overall survival,OS)及无复发生存(Relapse-free survival,RFS)的关系;1.2通过TCGA数据库,分析在TNBC患者中NAMPT-AS的表达量与预后的关系;2.临床样本验证NAMPT对于TNBC患者预后的影响通过组织芯片的免疫组化染色对NAMPT的表达水平进行定量,并分析在临床样本中NAMPT表达水平与OS及乳腺癌特异性生存(Breast cancer specific survival,BCSS)的关系;研究结果1.基于TCGA公共数据库分析NAMPT-AS的临床预后价值1.1通过对TCGA数据库的生存分析及齐鲁医院收集的乳腺癌样本的RNA表达量的检测显示,在包含各亚型的乳腺癌患者总体中,NAMPT-AS的高表达与OS、RFS不良密切相关;1.2 TCGA数据库分析显示,在TNBC患者中,NAMPT-AS的高表达也与不良OS及RFS密切相关;2.基于组织芯片分析NAMPT的临床预后价值临床样本染色分析证明NAMPT高表达与整体乳腺癌及TNBC患者的OS及BCSS预后不良密切相关。研究结论1.LncRNA NAMPT-AS/miR-548b-3p/NAMPT 的表达水平与 TNBC 的进展转移密切相关;2.NAMPT-AS/NAMPT高表达与整体乳腺癌及TNBC患者的预后不良密切相关,有望作为乳腺癌患者临床预后预测的重要因子;3.体内外实验均证明NAMPT-AS/NAMPT通过影响mTOR信号通路影响自噬进而调控TNBC的进展转移;4.体外实验证明NAMPT-AS从转录及转录后两个层面调控NAMPT的表达,一是招募转录因子POU2F2促进NAMPT的转录,二是竞争性结合miR-548b-3p减少NAMPT的降解从而促进NAMPT表达水平的升高。