【摘 要】
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阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种起病隐匿的神经退行性疾病,表现为神经元渐进性异常衰老和死亡。AD的主要病理特征为神经细胞内微管相关蛋白tau过度磷酸化形成神经纤维缠结和细胞外Aβ沉积为淀粉样斑块。尽管AD发生机制尚有许多未解之谜,但Aβ聚集提高AD风险仍是目前主流假说之一。有鉴于PSEN1是Aβ级联生成的限速酶——γ-分泌酶的催化亚基,通过调控PSEN1降低Aβ生成有
【基金项目】
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国家自然科学基金（31860301,31900410）；
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阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种起病隐匿的神经退行性疾病,表现为神经元渐进性异常衰老和死亡。AD的主要病理特征为神经细胞内微管相关蛋白tau过度磷酸化形成神经纤维缠结和细胞外Aβ沉积为淀粉样斑块。尽管AD发生机制尚有许多未解之谜,但Aβ聚集提高AD风险仍是目前主流假说之一。有鉴于PSEN1是Aβ级联生成的限速酶——γ-分泌酶的催化亚基,通过调控PSEN1降低Aβ生成有望作为AD的治疗靶点。miRNAs是一类19-24nt的非编码RNA,通过碱基互补可靶向一个或多个基因从而影响转录或翻译。挖掘AD发生发展过程中调控性的miRNAs及其对AD相关基因的靶向效应,可为AD风险防范及发生发展提供一条新的思路。本研究首先通过Target Scan、miRDB、miRwalk等网站预测到5个可能靶向PSEN1的候选miRNAs。将PSEN1 3’UTR序列克隆至双荧光素报告载体中后与候选miRNA模拟物（mimics）共转染HEK 293细胞,双荧光素酶报告分析实验验证目的miRNA对PSEN1的靶向性。结果提示,候选miRNAs中,仅miR-3940-5p组双荧光素酶活性较对照显著下降（P＜0.01）,提示其对PSEN1的靶向性。随后将PSEN1 3’UTR中的miR-3940-5p种子序列进行突变后再构建到报告载体中,双荧光素酶活性无显著变化,提示突变后的PSEN1与miR-3940-5p的靶向效应丧失,反向证实了miR-3940-5p对PSEN1的靶向性。为探究miR-3940-5p在靶向PSEN1基础上对基因表达的调控效应,研究将miR-3940-5p mimics或抑制剂（inhibitor）瞬时转染SH-SY5Y细胞。分别以RT-q PCR、Western Blot检测受试细胞PSEN1 mRNA与翻译水平变化。结果显示miR-3940-5p mimics显著调低PSEN1 mRNA水平（P＜0.01）和翻译（P＜0.001）,而miR-3940-5p inhibitor则显著上调PSEN1 mRNA水平（P＜0.05）,翻译上调但未达显著水平。为了进一步确证miR-3940-5p对PSEN1表达的靶向调控,运用慢病毒包装构建了稳定过表达miR-3940-5p的SH-SY5Y细胞系,发现该细胞系PSEN1 mRNA和翻译水平均显著低于对照（P＜0.001）。最后,为探究miR-3940-5p是否影响Aβ的产生,研究向过表达了人瑞典突变型APP的细胞SH-SY5Y APPswe瞬时转染miR-3940-5p mimic。ELISA分析发现,miR-3940-5p mimic显著降低受试细胞Aβ42（P＜0.01）、Aβ40（P＜0.01）含量。进一步通过慢病毒包装构建稳定过表达miR-3940-5p的SH-SY5Y APPswe细胞,ELISA结果显示,稳定过表达miR-3940-5p能显著降低细胞内Aβ42（P＜0.001）、Aβ40（P＜0.001）生成量。为验证miR-3940-5p-PSEN1-Aβ轴的存在,研究用RNA干扰的方法敲低SH-SY5Y APPswe细胞中PSEN1表达（si-PSEN1）,结果显示si-PSEN1组Aβ42、Aβ40水平均显著低于对照（P＜0.01、P＜0.001）。提示miR-3940-5p通过下调PSEN1参与Aβ生成。综上,该研究发现并证实miR-3940-5p可以从转录和翻译层面靶向抑制PSEN1的表达,从而间接参与了Aβ42和Aβ40的生成的调控。本研究为借助特异性miRNA对AD病理靶标的动态调控、干预AD发生风险提供了借鉴。
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