论文部分内容阅读
蓝光和温度是环境中的重要信号因子，能引起某些真菌的生物节律的变化，而蛹虫草（Cordyceps militaris）中产生和控制生物节律运转的是生物振荡器，其中心成分是frequency（CmFRQ）基因。本论文主要对生物振荡器的中心成分CmFRQ基因进行了克隆、序列分析并研究蓝光和温度对生物钟基因（CmFRQ）表达的影响。在GenBank中以已知的脉胞菌（Neurospora crassa）昼夜节律基因（NcFRQ）mRNA序列进行Blast分析，在蛹虫草全基因组序列中的Cordyceps militarisCM01contiq50序列中发现一段同源序列。通过ORF finder软件分析找到一段可能的蛹虫草CmFRQ-ORF序列。以此为依据设计引物，而后进行PCR、测序和比对，初步证明CmFRQ-ORF就是CmFRQ基因的开放阅读框（ORF），全长为2727bp。再根据CmFRQ-ORF序列和3’ RACE法设计引物，获得了CmFRQ基因的mRNA3’端部分656bp序列，和GenBank中的Cordyceps militaris CM01contig50进行比对，同源性较高。CmFRQ基因可编码903aa，对其进行序列分析表明，其中存在着1个coiled-coil结构域和1个LAM（LAmotif RNA-binding domain）功能域。将CmFRQ-ORF部分序列连接载体pEASY-E1Expression Vector，转化受体BL21（DE3）细胞，菌落PCR鉴定和测序分析表明， CmFRQ基因ORF部分序列原核表达系统基本构建成功。使用实时荧光定量PCR方法研究蓝光和温度对CmFRQ基因相对表达量的影响。结果表明CmFRQ基因的表达在不同蓝光时长对该基因影响不同，相对表达量呈现波浪式变化。在不同温度条件下，基因相对表达量有一定的变化，尤其是在18℃时CmFRQ的相对表达量最高。