广金钱草来源于豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.的干燥地上部分,具有抗炎、抗菌、解热利尿等功效,临床上用于治疗尿路结石。据文献报道黄酮类化合物为其主要药效成分。黄酮类化合物是植物界广泛存在的一类重要多酚成分,具有广谱的药理活性如抗氧化、抗炎、抗癌、降压等。本研究采用大孔吸附树脂法,通过静态吸附、解吸试验和动态吸附、解吸试验对广金钱草总黄酮的分离纯化条件进行了优化。通过吸附等温线模型对吸附机制进行了阐述。通过DPPH自由基清除能力试验以及还原能力试验对纯化后总黄酮提取物的抗氧化活性进行了评估。采用HPLC-ESI-MS/MS技术对广金钱草总黄酮提取物中的化学成分进行了鉴定。首先研究21个对照品的裂解规律,对于样品中化合物的鉴定联合采用MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI模式,最终通过保留时间、质谱信息以及文献中给出的相关信息共分析鉴定出53个化合物。此外,通过HPLC-ESI-MS/MS分析方法对广金钱草总黄酮提取物中的25种化学成分进行了定量分析。第一部分广金钱草总黄酮纯化工艺优化及总黄酮提取物的抗氧化活性研究目的：对分离纯化广金钱草总黄酮的工艺条件进行优化,并对纯化的总黄酮提取物的抗氧化活性进行评估。方法：以吸附量、解析量以及解析率为评价指标对6种型号(HPD-100、 D101、AB-8、DM130、S-8和NKA-9)的树脂进行筛选,选择最佳树脂。通过静态和动态吸附解吸试验对分离纯化条件如上样浓度、上样体积、解析溶剂、解析溶剂用量等进行考察。通过吸附等温线的两个经典模型即Langmuir和Freundlich模型对吸附机制进行了阐述。此外,以抗坏血酸(Vc)为阳性对照,通过DPPH自由基清除能力试验以及还原能力试验对纯化后的总黄酮提取物的抗氧化活性进行了评估。结果：DM130型树脂吸附解吸效果最佳；优化的吸附条件：上样浓度为8.09 mg/mL(约相当于总黄酮的浓度)；上样量为3BV；优化的解析条件：超纯水洗至流出液近无色,10%的乙醇洗脱6BV,弃去；最后用50%的乙醇洗脱6BV,收集洗脱液,浓缩,冻干,得冻干粉末约0.72 g。经过一次处理后,总黄酮的纯度由粗提物中9.48%提高到54.30%,收率为80.59%。抗氧化试验结果：(1)当PTFE的浓度由0.01 mg/mL增夹到0.18 mg/mL时,DPPH自由基的清除率由12.90士0.47%增加到91.40士1.37%,ICso为0.046 mg/mL,相同浓度的样品和Vc (0.09 mg/mL),清除率分别为71.48士0.83%和74.80士1.07%。(2)还原能力试验结果如下：当PTFE的浓度由0.10mg/mL增加到0.80 mg/mL时,吸光度由0.34增加到1.06,相同浓度的样品和Vc (0.10mg/mL),吸光度分别为0.34和0.48。结论：优化的分离纯化条件适用于广金钱草总黄酮的分离纯化,纯化后的总黄酮提取物具有良好的抗氧化活性且抗氧化能力随浓度的增加而增强。第二部分广金钱草总黄酮提取物中53个化合物的结构鉴定目的：建立灵敏、有效的液质联用方法用于鉴定广金钱草总黄酮提取物中的化学成分。方法：精密称取提取物粉末10 mg至10 mL容量瓶中,加50%乙醇适量,超声溶解,定容至刻度。进样前使用0.45 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液进行HPLC-ESI-MS/MS分析。色谱柱为ZORBAX SB-C18 (250 mm ×4.6 mm,5.0μm),流动相为甲醇(A)-0.1‰乙酸水(B),梯度洗脱,洗脱程序如下：0～42 min,25～38%A; 42～70 min,38～60% A; 70～75 min, 60～95% A; 75～80 min,保持95%A不变。预平衡10 mmin,柱温：室温,流速：1.0mL/min,进样量：20μL。质谱条件：ESI源；源温度(TEM)：650℃；正、负离子检测源电压分别为5500 V和-4500 V；雾化气(gasl)、加热气(gas2)和帘气(CUR)分别为60 psi、65 psi和25 psi。扫描模式：联合采用多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描(MRM-IDA-EPI)和母离子扫描-信息依赖-增强型子离子扫描(PREC-IDA-EPI)模式分析鉴定广金钱草总黄酮提取物中的化学成分。结果：基于化合物的保留时间,质谱数据以及文献信息共分析鉴定出广金钱草总黄酮提取物中的53个化合物,包括4个酚酸、4个黄酮苷元、24个黄酮C-苷、6个黄酮O-苷、3个黄酮醇苷元、4个黄酮醇0-苷、2个二氢黄酮苷元、1个二氢黄酮O-苷、1个异黄酮苷元和4个异黄酮O-苷,其中有25个化合物的结构通过与对照品对比保留时间和质谱信息得到了准确的鉴定。结论：本研究首次建立了利用HPLC-ESI-MS/MS技术定性鉴定广金钱草总黄酮提取物中化学成分的方法。本法灵敏度高、专属性强,化学成分的鉴定对控制中药材质量具有重要意义。第三部分广金钱草总黄酮提取物中25种化学成分的含量测定目的：建立一种快速、准确的HPLC-ESI-MS/MS分析方法同时测定广金钱草总黄酮提取物中25种化学成分(包括4个酚酸、4个黄酮苷元、5个黄酮C-苷、1个黄酮O-苷、3个黄酮醇苷元、3个黄酮醇O-苷、2个二氢黄酮苷元、1个二氢黄酮O-苷、1个异黄酮苷元和,1个异黄酮0-苷),并用于6批提取物样品的分析。方法：精密称取总黄酮提取物粉末25 mg,置50 mL容量瓶中,加入50%乙醇溶液适量,超声使溶解,放冷,用50%乙醇定容至刻度。进样前采用0.45 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液进样分析。液相条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18 (250 mm × 4.6 mm,5.0μm),流动相为甲醇(A)-0.1%o乙酸水(B),梯度洗脱,洗脱程序如下：0-35 min,25-42% A; 35-42 min, 42-95% A; 42-47 min,保持95%A不变。预平衡10 mmin,柱温：室温,流速：1.0 mL/min,进样量：10μL。质谱条件：采用电喷雾离子化源(ESI)；源温度(TEM)为650℃；采用MRM扫描模式,源喷射电压(IS)为-4500V；雾化气(gas1)：60 psi,加热气(gas2)：65 psi,帘气(CUR)：25 psi。25种被测成分的监测离子对分别为152.9/108.9(原儿茶酸)179.0/134.9(咖啡酸)、193.0/133.9(阿魏酸)、353.1/191.0(绿原酸)、255.0/119.0(甘草素)、269.0/117.0(芹菜素)、269.1/133.0(染料木素)、431.0/268.0(染料木苷)271.0/150.9(柚皮素)、283.0/268.0(刺槐素)、284.9/92.9(山奈酚)、285.0/133.0(木犀草素)、299.0/284.0(香叶木素)、607.1/299.0(香叶木苷)300.9/150.9(槲皮素)、315.0/300.0(异鼠李素)、463.2/300.1(金丝桃苷/异槲皮苷)、609.2/300.0(芦丁)、609.3/301.1(橙皮苷)431.2/311.1(牡荆素／异牡荆素)、563.2/353.0(夏佛塔苷／异夏佛塔苷)和447.2/357.1(异荭草苷)。结果：25种对照品在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,相关系数均大于0.9977,仪器精密度、日内和日间精密度RSD分别小于2.3%、2.8%和4.4%,平均加样回收率为98.1%-104.4%,稳定性峰面积RSD小于4.0%。方法学验证结果表明方法的准确度高、重复性好。样品测定结果表明,6批样品中化合物的含量变化趋势基本一致。结论：本法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于广金钱草总黄酮提取物中25种成分的含量测定,为广金钱草总黄酮提取物的质量控制提供了依据。