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流感大爆发常常给人类社会造成不可估量的经济损失甚至威胁生命安全,目前接种流感疫苗是预防流感最有效的措施。采用传统的鸡胚生产工艺生产流感疫苗,存在质量不稳定、致敏性、潜在污染、规模放大受限等问题；基于MDCK细胞微载体培养体系生产流感疫苗成本高、操作复杂；而采用现有的商业无血清培养基进行细胞悬浮培养生产流感疫苗时,存在细胞适应悬浮生长周期长,无法实现细胞高密度培养,最终影响病毒产量等问题。因此,迫切需要开发适于MDCK细胞悬浮培养的无血清培养基,建立基于MDCK细胞无血清悬浮培养的病毒生产工艺。本文以培养流感病毒的MDCK细胞为研究对象,首先通过Mixture design实验设计方法,分别对5种自制的无血清培养基和5种添加物进行混料筛选,以快速建立和优化用于MDCK细胞生长的无血清培养基。结果发现,与原有的无血清培养基SFM相比,新开发的无血清培养基XP能使MDCK细胞生长的最高活细胞密度提高82.4%；与商业无血清培养基相比,基于该无血清培养基,通过简便的驯化方法使MDCK贴壁细胞仅在3周内适应悬浮培养并稳定生长,大大缩短了驯化周期,且细胞形态饱满、大小均一、无结团现象。驯化后的细胞在批培养模式下最高活细胞密度达(14.05±0.07)×106 cells/mL,平均比生长速率达0.63 d-1。进一步考察了MOI (multiplicity of infection)和胰酶对细胞生长及病毒产量的影响,结果发现,当MOI=0.01、胰酶浓度为5.0μg/mL时,既能保证病毒具有较强的感染力,也可获得较高的病毒产量。为了解决批培养模式下存在的营养限制等问题,优化了基于无血清培养基XP和流加培养基FM两种流加培养基的流加策略。结果表明,当细胞接种密度为1.0×106 cells/mL、培养72 h时,流加100%体积的无血清培养基XP可以解决营养限制等问题,并在一定程度上降低了代谢副产物的累积,同时获得的最高血凝效价为213.00±0.00 HAU/50 μL,单细胞产毒量为(47224±35) virions/cell。与批培养过程相比,血凝效价提高了3个效价单位,单细胞产毒量提高了168%。通过本文的研究,在较短的时间内开发了基于MDCK细胞生产流感疫苗的无血清培养基和无血清流加培养工艺,为流感疫苗的高效大规模工业化生产奠定了基础。