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纳米SiO2是目前世界上大规模工业化生产产量最高的纳米材料之一,广泛应用于塑料工程、杀菌剂、农业及涂料等领域,人们在日常工作和生活中接触到纳米SiO2的机会越来越多。纳米材料的大小与较大蛋白质的尺寸相当,有可能通过简单扩散或渗透的形式通过肺血屏障和皮肤进入体内,易于透过生物膜上的孔隙进入细胞内或细胞内包括线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体和细胞核等细胞器内,并与生物大分子发生结合或催化反应,导致体内一些激素和重要酶系的活性丧失。注入到气管内的纳米TiO2颗粒(3 nm)可通过破坏血脑屏障造成大脑损伤,有剂量-效应关系。硅纳米粒子尾静脉注射小鼠,透射电镜下可见在脑、肝、心、脾、肺等器官组织均有分布。8、13和37 nm三种不同粒径的Fe2O3纳米粒子在细胞毒性上表现出一定的差异,粒径分布较小的粒子毒性比大粒径的粒子要大。随着粒径的减小,粒子表面积明显增加,单位质量纳米粒子具有更强的生物活性,一些原本无毒或毒性小的材料开始出现毒性或毒性明显加强。众所周知以石英为代表的结晶型SiO2是典型的肺毒物。在纳米尺度上,纳米SiO2的理化性质发生巨变,其生物学效应的性质和强度是否会发生质的变化?这种新材料可能带来的生物安全性方面的问题日益受到关注。有资料显示:纳米SiO2对大鼠肺部的急性损伤作用比微米SiO2强,但对大鼠肺部致纤维化作用比微米SiO2弱。纳米SiO2在体外对红细胞、巨噬细胞及A549细胞等均表现出不同程度的毒性作用。
由于尺寸小,机体对纳米材料的反应程度也随粒径大小不同而有异。因此,在纳米尺度上,除了剂量以外,尺寸大小也是决定纳米颗粒毒性大小的一个重要因素。即使同一种物质、同一种形态、同一个剂量,只要尺寸大小改变,它们的生物效应(尤其是生物毒性)就需要重新测试评价。为此,对同一纳米材料不同粒径之间可能存在的潜在生物学效应的差异进行研究是非常必要的。目前在体内体外实验中均发现纳米SiO2与微米SiO2之间生物学效应存在差异,而对于不同粒径纳米SiO2潜在生物学效应及其差异性的研究还较少。考虑到游离SiO2进入体内后引发巨噬细胞自由基链式反应,释放大量细胞因子,使成纤维细胞增生,胶原代谢紊乱,最终导致肺纤维化,本课题以微米SiO2为阳性对照,RAW264.7细胞和中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)为研究对象,旨在通过培养细胞体外染尘的方法,探讨不同粒径纳米SiO2粒子(20-nm、60-nm)的细胞毒性作用及相关机制,比较不同粒径纳米SiO2对细胞损伤的差异性及其与微米SiO2的差别,为纳米SiO2生物学效应研究及卫生标准的制定方面提供毒理学实验基础资料。实验结果如下:
1.20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2粉尘体外作用于红细胞后,可引起红细胞溶血。一定浓度下,20-nmSiO2致红细胞溶血率较60-nm SiO2及微米SiO2高(P<0.05)。20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2在一定浓度范围内致红细胞产生MDA的量随其浓度的增加逐渐升高,呈剂量-效应关系(R2>0.9,P<0.01)。相同浓度20-nm SiO2致红细胞MDA生成量较60-nm SiO2多(P<0.05)。
2.一定浓度范围内,20-nm、60-nM SiO2(0-24 mg/ml)和微米SiO2(0-32 mg/ml)对RAW264.7细胞活力均有不同程度的抑制作用。MTT法测得20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2对RAW264.7细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为2.07、6.82和14.71 mg/ml。光学和荧光显微镜下观察,500.00μg/ml20-nm、60-nmSiO2及微米SiO2可致贴壁细胞数量减少、体积增大、呈气球样变。透射电镜下观察染毒RAW264.7细胞内线粒体肿胀、嵴断裂、胞质内空泡增多。能谱仪分析显示染毒细胞超微结构中吞噬泡内的颗粒和细胞间隙的颗粒均含有Si元素。
3.125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2致细胞培养液中LDH活性增加(P<0.05)。500.00μg/ml两种粒径纳米SiO2组LDH活性高于微米SiO2组(P<0.05)。500.00μg/ml20-nm SiO2组LDH活性高于同浓度60-nm SiO2组(P<0.05)。经激光扫描共聚焦显微镜检测,31.25、125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2组细胞膜荧光恢复能力均降低(P<0.05)。500.00μg/ml20-nm SiO2组细胞膜荧光恢复能力低于微米SiO2及60-nm SiO2组(P<0.05)。125.00、500.00μg/ml两种粒径纳米SiO2组细胞膜扩散系数低于阴性对照组(P<0.05)。经Ca2+敏感探针Fluo-3/AM检测得500.00μg/ml两种粒径纳米SiO2组细胞内[Ca2+]i含量在测定各时间点均升高(P<0.05);在31.25、125.00μg/ml时,细胞内[Ca2+]i含量出现瞬间、暂时性升高,而后又逐渐恢复至细胞正常状态水平。同浓度下,两种粒径纳米SiO2致细胞内[Ca2+]i含量升高的现象较微米SiO2明显(P<0.05)。个别作用时间点,20-nm SiO2致细胞内[Ca2+]i含量升高的作用强于60-nm SiO2(P<0.05)。500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2可诱导RAW264.7细胞内脂质过氧化指标(MDA、O2-·、·OH、NO、H2O2)水平升高。通过DCFH-DA荧光探针测定得125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2组在染毒4h后,随着时间的延长,细胞内活性氧水平急剧升高。31.25μg/ml20-nm、60-nm SiO2组细胞内活性氧水平在4-8 h之间升高较快,而后呈缓慢升高趋势。微米SiO2组在染毒2h、4h、8h、16 h、24 h时细胞内活性氧水平呈直线上升趋势,较20-nm、60-nm SiO2组作用明显。
4.500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2染毒RAW264.7细胞后,其培养上清液致CHL细胞增殖率增加(P<0.05)。500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2组上清液致CHL细胞增殖率低于微米SiO2组(P<0.05)。31.25、125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2组上清液致CHL细胞羟脯氨酸生成量增加(P<0.05);500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2组羟脯氨酸的生成量高于同浓度微米SiO2组(P<0.05)。125.00、500.00μg/ml两种粒径纳米SiO2组上清液致CHL细胞MMP-2阳性表达率增加(P<0.05)。500.00μg/ml20-nm SiO2组MMP-2阳性表达率高于微米SiO2组及60-nm SiO2组(P<0.05)。125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2致TGF-β1生成量增加(P<0.05);125.00μg/ml和500.00μg/ml20-nm SiO2、500.00μg/ml60-nm SiO2及微米SiO2致IL-1β生成量增加(P<0.05)。
以上结果提示20-nm、60-nm SiO2粒子在导致MDA升高的同时引起红细胞溶血;两种不同粒径纳米SiO2可通过诱导脂质过氧化作用引起细胞形态和超微结构改变、细胞膜流动性下降及通透性升高、细胞内游离Ca2+水平增高,从而使体外培养RAW264.7细胞的生长受到抑制、结构和功能受到损伤;两种粒径纳米SiO2刺激RAW264.7细胞的培养上清可致细胞因子TGF-β1、IL-1β和基质金属蛋白酶MMP-2释放量增加,由此促进CHL细胞增生,胶原合成增多,具有潜在的致纤维化作用。在上述毒性效应中,20-nm SiO2产生的毒性效应较60-nm SiO2明显,提示不同粒径纳米SiO2对细胞的毒性作用有差异。