作为一种多功能的多羟基盐,葡萄糖酸钠(sodium gluconate;SG)被广泛应用于食品、药品、清洁剂、建筑等行业中。本文以黑曲霉(A.nigger)深层发酵生产SG为研究对象,根据A.niger 自身生理代谢以及合成SG的细胞外酶反应的特点,首先围绕氧代谢采用高通量筛选技术获得同时具有高氧亲和力和高产葡萄糖酸钠能力的菌株,并且利用计算流体动力学(CFD(computational fluid dynamics))模拟技术研究生物反应器内流场氧传递分布信息,而后通过多尺度参数相关分析以及代谢流定量分析等技术进行交叉研究,对原SG工业分批发酵生产工艺进行了系统优化并深入剖析了氧传递对SG生产过程中的重要影响。在此基础上,利用在线敏感参数(OUR(oxygen uptake rate),CER(carbon dioxide evolution rate),DO(dissolved oxygen),and RQ(respiratory quotient))相关性变化规律,实现了利用在线生理参数实时反馈调节补料速率的细胞循环式连续发酵(cell-recycle continuous fermentation;CRCF)生产SG新工艺,并且成功放大至工业规模生产中。具体研究内容如下:(1)本研究从原始A.niger FY149出发,采用常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma;ARTP)方法形成突变库,建立了以含有无水Na2SO3的平板为高氧亲和力选择压力模型、溴甲酚绿pH指示剂为检测方法的SG高产黑曲霉菌株的高通量筛选方法。在含有CaCO3和Na2SO3的平板上培养进行初筛,选择透明圈直径与菌落直径比较大菌株进行含有溴甲酚绿的孔板培养,实现了高通量筛选同时具有高氧亲和力和高产葡萄糖酸钠菌株的高效筛选模型,并且成功筛选获得了高产菌株A.niger Ⅳ-7-C6。该菌株与原始菌相比,产SG速率提高了 19.5%,转化率提高了 5.8%。研究结果表明,其对氧气亲和力的提高可能是其较原始菌株高产的原因。之后,建立了该高产菌株的菌体生长、底物消耗以及产物合成的动力学模型,揭示了其自身生理代谢与产物合成的关系。其次,还考察了初始糖浓度造成的不同初始渗透压对菌体生长以及产物合成的影响,确定了种子培养的初始糖浓度为250.0 g L-1,该糖浓度既对菌体生长影响较小,且能够胁迫菌体合成较多的葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase;GOD)用于SG的合成。(2)通过黑曲霉自身生理代谢以及合成SG的细胞外酶反应特性,建立了利用在线生理参数(OUR、CER以及RQ)实时计算公式(式1和式2)与监控发酵过程关键参数的方法,成功实现了在线定量监控产酸转化率以及产率的目标。简而言之,在线参数与SG发酵过程关键参数(产酸速率rp以及得率Yp)的关系可以概括为如下三个原则:发酵过程中CER可以用来表示菌体的生长以及活力,因为葡萄糖酸钠合成的酶反应不释放二氧化碳;更高的OUR意味着更快的葡萄糖酸钠的生产速率;更低的RQ值意味着更高的得率。式中rp(gL-1 h-1)与Yp(mol mol-1)分别为SG发酵过程中实时产酸速率以及得率。在此基础上,将工业生产SG工艺(160m3发酵罐)scale-down至50-L发酵罐中,通过在线相关参数分析方法,找出了影响工业发酵的限制性因素:培养基营养过剩以及供氧不足。针对这些发现的问题,对原发酵工艺培养基进行了优化并开发了阶段性提高搅拌转速的供氧新策略。优化后的分批发酵过程发酵周期由34.0 h下降至约19.0 h,总得率为0.943±0.012 mol mol-1,较初始发酵提高了约16.0%。培养基的改进缩短了分批发酵的延滞期,并且降低了发酵液中菌体浓度(由5.0 gL-1降至1.5 g L-1)。搅拌方式的改变分别从气液传质方面改善了过程的氧气传递速率(oxygen transfer rate;OTR),有利于发酵过程中SG的合成。根据发酵实验结果发现,OTR一直对发酵过程处于限制状态,任何提高发酵过程OTR的方法都有利于SG发酵过程。通过定量计算优化前后发酵工艺的菌体代谢流,发现原发酵过程中糖酵解途径(EMP途径)以及三羧酸循环(TCA循环)的代谢通量明显较高,可能是因为原发酵过程需要有更多的葡萄糖用于细胞生长与维持。除此之外,优化后发酵工艺中,副产物柠檬酸的代谢通量则有显著下降。菌体自身代谢与维持消耗的碳源降低以及发酵液中副产物(柠檬酸)的明显减少是优化后发酵过程取得SG高得率的主要原因。(3)考虑到高菌浓时,分散丝状菌形会较大地提高发酵液粘度,从而对气液传氧不利。因此,目前葡萄糖酸钠发酵过程中大部分还是使用呈菌球团状黑曲霉进行发酵。但是,菌球状菌形虽然能够降低发酵液粘度,但是会导致菌球内部氧气以及营养元素扩散的障碍,从而导致菌球中心位置菌丝的低效发酵甚至是裂解。对原发酵工艺的营养盐进行调整后,使得发酵过程的菌浓大幅度降低。因此,本研究考察了在低菌浓发酵时,采取分散状菌形对SG发酵的影响。结果发现,在低菌浓条件下,菌形的改变对发酵液粘度影响较小,却使得发酵过程的体积氧传递系数(kLa)提高了约13.0%,表明分散菌形能够很大程度地提高发酵液中氧气与菌丝体的接触面积,从而提高了整个发酵过程的OTR水平。使用分散菌形进行发酵,分批发酵周期由19.0h进一步缩短至15.0h左右,得率也有进一步的提高。(4)在SG分批发酵过程优化的基础上,本研究组首次尝试了利用膜装置截留菌丝体回流至发酵罐中进行连续发酵的新工艺并利用陶瓷膜装置建立了细胞循环式膜反应器(cell-recycle membrane fermentor;CRMF)系统。在 CRMF 系统建立后,首先进行了固定补料速率的细胞循环式连续发酵过程。结果发现该过程中OTR水平较分批发酵存在多样性变化:通过CFD模拟技术比较了普通反应器以及膜反应器的流场,确定了膜装置额外的功率输入使得膜反应器OTR水平较普通反应器高;而在连续发酵添加消泡剂的过程中,反应器的OTR水平快速下降。OTR升高时应提高补料速率以使发酵产率最大化,而在OTR下降时,需降低补料速率以防止出料中底物葡萄糖浓度的升高从而导致碳源的浪费和得率的降低。因此,为了实现在当前OTR水平下最高的产率以及最低的残糖浓度,开发了使用在线生理参数OUR以及DO相关性变化趋势反馈调节补料速率的SG连续发酵新工艺并成功地实现了全自动化连续发酵过程。使用该自动化工艺,能够使得连续发酵周期达240.0 h以上,SG产率较分批发酵过程提高近三倍,得率较分批发酵过程进一步提高5.4%,为0.984 mol mol-1左右,已经十分接近理论转化率(1.0 mol mol-1)。由于膜装置额外功率输入以及菌形进一步分散使得CRCF过程中OTR水平较分批发酵更高,从而使得CRCF过程中OUR水平高,TCA循环中产生的柠檬酸较少。此外,由于细胞循环使用,所以用于菌体生长以及维持的碳源较分批发酵更少。这些因素是CRCF获得高得率的原因。最后,利用商品化GOD酶液进行了酶法生产SG的实验。利用已获得的在线定量描述产酸速率和得率的方程对酶法生产SG工艺过程进行在线动态监控与优化。成功开发了利用在线生理参数变化特点阶段性补入酶液的酶法生产SG新工艺,使得反应周期较初始一次性加入粗酶液的原工艺缩短5.0 h左右,且酶液用量减少了约19.4%。经过本研究的全局优化以及新工艺开发过程,SG总生产能力较初始分批发酵过程提高3倍以上,得率能够达到0.98 mol mol-1,较初始工艺提高近21.0%。此SG生产速率与得率均为目前所报道的文献中最高。最终使得SG总生产成本降低约50.0%,大幅提高了企业的市场竞争力。