研究背景与目的:间充质干细胞来源的外泌体在皮肤缺损修复及其潜在的血管生成的过程中,具有生物学利用的巨大潜质,是细胞学移植方法的替代。该实验,旨在探究去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体在皮肤缺损的修复中具有良好的成血管作用以及其内在的具体机制。为了探究外泌体使用的促进血管生成的效果,人脐静脉内皮细胞的许多相关功能性实验,例如,成管实验,划痕实验,增殖实验都被实践并验证。为了在体外实验中验证去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体的具体效果,STZ诱导的糖尿病大鼠的皮肤缺损模型被我们建立起来。在模型建立的两个星期之后,我们用组织学等分析方法去评估皮肤缺损的愈合效果,我们使用小动物CT来验证新生血管的多少。我们的结果可以证实,去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体可以刺激通过刺激mi R-126来刺激PI3K/AKT信号通路,从而促进人脐静脉内皮细胞的血管新生的活动。我们的实验结果证实了去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体能够促进血管新生活动的潜质并作为一种无细胞的干预方法在未来得到应用。方法:1.外泌体的收集和鉴定1.1外泌体的收集:外泌体从条件培养基中被收集,通过经典的超速离心法结合超滤被收集。1.2外泌体的鉴定:我们使用透射电子显微镜来观察外泌体的形态,我们使用可调电阻脉冲感应技术来分析外泌体的直径和具体尺寸的分布情况。我们使用Western Blot技术来确定外泌体表面的标志物。2.体外实验去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体能够促进血管新生,不同处理的外泌体被我们用验证促进血管新生的效果,我们通过CCK8实验,Matrigel表面成管实验,划痕实验分别验证其增殖,成管和迁移的能力。3.去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体对糖尿病大鼠皮肤损伤的修复的作用3.1我们构造了糖尿病大鼠皮肤缺损的模型,然后我们在缺损的多个地点注射了外泌体或者等量的PBS溶液。3.2我们评估了不同处理的外泌体在糖尿病大鼠的皮肤缺损上的愈合效果并且计算了在第4和14天时候皮肤缺损面积的减少。3.3我们使用H&E染色评估了皮肤再上皮化和皮肤瘢痕愈合的程度,我们使用Masson染色来观察创面胶原的再生情况。4.去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体对皮肤缺损中血管新生的效果4.1我们microfill灌注液来灌注大鼠的血管从而使得我们能够使用小动物CT来重建皮肤缺损处的血管。4.2我们采用CD31和α-SMA免疫荧光染色这两个免疫荧光的染色指标来确定皮肤缺损处血管的血管新生和血管成熟的情况5.去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体促进血管生成的机制5.1我们使用q RT-PCR技术来确定具体参与去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体参与的血管新生作用的具体分子。5.2我们Dio标记的去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体与人脐静脉内皮细胞一起共培养,并通过荧光显微镜来检测血管内皮细胞对去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体的摄取情况。5.3 PI3K/AKT信号通路被认为是mi R-126的靶向通路,对于调控迁移,增殖和细胞的生存都具有巨大的作用。Western Blot技术被用于确认去铁胺预处理的间充质干细胞来源的外泌体刺激后PI3K/AKT信号通路中蛋白质的变化。6.DFO-Exos通过PI3K/AKT信号通路在人脐静脉内皮细胞中产生作用6.1在DFO-Exos处理之后,通路中相关分子经过western blot所检测。6.2使用成管实验与迁移实验验证相关分子的功能性。结果:1.外泌体的鉴定1.1外泌体的典型蛋白标志物,CD9,CD63,TSG101,和GM130在Exos and DFO-Exos都被检测到。1.2在TEM的检查之下,外泌体是具有膜结构的小囊泡,圆形的形状,其粒径在30-100纳米之间。1.3外泌体的粒径在18到182纳米之间,其平均粒径在75纳米,提取的外泌体的浓度在6.65×108颗粒/毫升。2.外泌体在体外促进血管新生2.1间充质干细胞的外泌体与去铁氨处理的间充质干细胞的外泌体都促进了内皮细胞的增殖,在24小时和48小时这两个时间点,实验组和对照组相比都促进了内皮细胞的增殖。2.2划痕实验证实了人脐静脉内皮细胞与实验组的去铁氨处理的间充质干细胞的外泌体共培养了之后,其迁移的速度比两个对照组都显著。2.3细胞迁移侵袭试验用于验证去铁氨处理的间充质干细胞的外泌体与人脐静脉内皮细胞共培养后的迁移效应,实验组显著快于对照组。2.4成管实验中,在不同处理的外泌体以及PBS对照组与人脐静脉内皮细胞共培养后,实验组与对照组相比,实验组可以观察到更多的管样结构。3.大体实验:STZ诱导的糖尿病大鼠的皮肤缺损模型的修复情况3.1在第七,第十四天这两个时间点中,外泌体实验组与对照组相比,实验组的缺损的愈合速度显著地快于对照组,两个外泌体实验组相比,预处理间充质干细胞的外泌体组的愈合速度快于未预处理的外泌体组。3.2造模的14天后,实验组在再上皮化的程度和瘢痕的大小两个指标上快于对照组,此外,实验组的胶原沉积的面积要快于对照组。4.糖尿病大鼠的皮肤缺损的血管新生的效果4.1造模后14天,小动物CT所重建的3D图像能够看出新生血管的密度,DFOExos和Exos实验组超过空白对照组,此外DFO-Exos的新生血管的密度超过Exos组。4.2经过皮肤缺损处新生血管的量化分析,根据相关的结果,DFO-Exos和Exos实验组的血管数量要超过超过空白对照组,其中DFO-Exos和Exos这两个实验组时间,DFO-Exos的血管数量超过Exos组。5.DFO-Exos介导mi R-126进入人脐静脉内皮细胞5.1许多外泌体中的和血管新生调控相关的mi RNAs,如mi R-214,mi R-21,mi R-126,mi R-125b mi R-27b,and mi R-19b等都被PCR技术检测,我们发现在其中mi R-126的改变最为显著。5.2荧光显微镜证实了外泌体被人脐静脉内皮细胞所摄取。超过百分之九十的内皮细胞在八个小时后表现出了DAPI,这说明被DIO标记的外泌体进入了内皮细胞的胞浆。6.DFO-Exos通过PI3K/AKT信号通路在人脐静脉内皮细胞中产生作用6.1在DFO-Exos处理之后,经过western blot所检测,人脐静脉内皮细胞中的PIK3R2分子的数量有所降低,p AKT的数量有所增高,这个结果让我们设想或许mi R-126分子通过PI3K/AKT来改变了基因的表达从而影响人脐静脉内皮细胞的血管新生的效应。6.2在26I-DFO-Exos这一组中,经过WB所验证,PIK3R2的分子数量有所上调同时p AKT分子的数量有所减少,在transwell assay的验证实验中,126IDFO-Exos实验组的细胞迁移的速度低。在成管实验的验证实验中,管状物的长度和分枝数量,126I-DFO-Exos实验组都低于对照组。这些实验证实了mi R-126参与了去铁胺预处理的间充质干细胞的外泌体能够促进人脐静脉内皮细胞的血管生成活动增加的过程。