论文部分内容阅读
水稻纹枯病菌在致病过程中可以产生毒素、胞壁降解酶和黑色素等致病因子,而寄主为了阻止病菌的侵入与扩展,亦可编码相应分解或抑制这些致病因子的抗性物质,本研究对病菌的致病因子与寄主相关抗性基因进行了初步研究,拟为进一步进行病原物与寄主互作研究打下基础。
为建立可靠的水稻纹枯病苗期抗性鉴别体系,经多年研究,从数百份水稻种质中筛选出68个品种(系)进行连续两年的田间接种试验,从中选出抗性分别为抗、中抗、中感、感和高感的品种YSBR1、C418、Jasmine85、武育粳3号和Lemont作为鉴别品种。从海南、福建、云南、广西、广东、湖南和江苏等地数百株菌株中筛选出30个菌株进行苗期致病力测定,从中选出致病力分别为强、中、弱的菌株C30、E67和YN-3作为鉴别菌株。为了与以前研究结果相联系,增补了致病力处于C30与E67之间的华南农业大学常用菌株GD118和扬州大学农学院常用菌株YN-7作为鉴别菌株。初步建立了一套具5个鉴别寄主和5个鉴别菌株的苗期抗性鉴定体系,将中选品种与菌株进行大田验证,结果与苗期趋势一致。利用该体系对江苏省90个水稻纹枯病菌菌株致病力分化进行了初步研究,动态聚类表明,可将之明确分为致病力强、中、弱三类,这与多数前人的研究具有一致性。
毒素作为水稻纹枯病菌致病因子,在致病过程中起重要作用,菌株产生毒素的能力与其致病力呈显著正相关,但对其毒素的本质一直未有定论。本文比较了前人的研究方法,结果表明,不同提取方法所得产物具有相同的紫外吸收峰,萃取用有机溶剂以乙醚为最佳。通过两次SephadexG-75柱层析,将纯化的精毒素通过HPLC、TLC、IR和GL-MS分析表明,该毒素的主要成分为碳水化合物,包括葡萄糖、N-乙酰氨基甘露糖以及蔗糖等。稳定性分析表明,该毒素对长时间光照、高温、强酸或强碱、强氧化性的化合物等都不稳定。利用毒素对水稻胚根伸长的抑制、细胞膜的破坏作用可很好的区分品种的抗感性,但对不同品种幼苗的致萎时间却与品种抗性无关。
胞壁降解酶是水稻纹枯病菌另一个重要致病因子,在众多胞壁降解酶中以多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性最高。实验条件下,纹枯病菌PG的产生受培养时间、温度、振荡条件、C源、葡萄糖浓度及培养液pH的影响,而活性受缓冲液pH和温度的调控。以葡萄糖为最适碳源,但在高浓度葡萄糖(≥5%)条件下,PG的产生受到抑制;在50℃,缓冲液pH5的条件下,PG活性最高。通过丙酮沉淀和DEAESepharoseFastFlow离子交换柱、Phenyl-Sepharose6FastFlow疏水柱、SephadexG-75凝胶柱和DE52离子交换柱层析,得到一分子量为39.81kD、等电点4.58、含糖量为1.48%的纯蛋白,该纯蛋白不含脂和芳香族氨基酸。
据GenBank和相关文献设计引物扩增Rspgl基因,获得一长1395bp的完整开放阅读框。RT-PCR分析表明,该基因含有5个内含子(278~334,57bp;545~601,57bp;657~715,59bp;1090~1155,66bp;1244~1304,61bp),编码区为1095bp,翻译成含有364个氨基酸的RsPG1。生物信息学分析表明,RsPG1中含有所有生物PGs特有的严格保计序列180NTD、202DD、223GHG和255RIK,存在一18个氨基酸的信号肽分子;二级结构以α-螺旋、β-折叠和随机卷曲为其基本结构单元,6个半胱氨酸残基形成3个二硫键,跨膜结构预测以从胞内向胞外分泌为主;三级结构为10个重复的β-折叠环按右手螺旋规则排列形成的螺旋结构,含有一个开放的有活性的裂隙结构,3D预测图除少数几个位点与FmPG有细微差异外,其它结构基本完全一致。
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物细胞壁上能特异性识别和结合真菌PGs并抑制其活性的蛋白,它能促进植物体内具有激发子活性的寡聚糖的积累,激发防卫机制和调节基因表达,从而提高和延长植物的抗性反应,在植物抗病过程中起重要作用。水稻中存在四个OsPGIP分子,其中OsPGIP1对植物病原真菌PG有较好的抑制作用。据GenBank和相关文献设计引物,扩增获得一长930bp的完整开放阅读框。编码产物生物信息学分析表明,OsPGIP1由309个氨基酸组成,存在一17个氨基酸的信号肽,含有9个LRR重复,与其它植物PGIP相比,其第7个LRR重复缺失;二级结构主要以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕为结构元件,不存在卷曲螺旋,8个半胱氨酸残基可形成3个二硫键,无跨膜结构存在;三级结构LRR区以9个α-螺旋和9个β-折叠将整个蛋白组装成一个具有较大裂隙的空间结构,该裂隙区负责着蛋白质与植物病原真菌PG互作的主要功能。
原核表达表明,表达产物OsPGIP1主要以包涵体形式存在,表达条件以0.4mMIPTG、25℃下诱导表达12小时为宜,表达产物对水稻纹枯病菌及其PGs都有明显的抑制作用。将Ospgip1基因连接至过表达载体,并以农杆菌转化拟南芥,获得的转基因苗接种纹枯病菌后虽然在病斑大小上与对照无显著差异,但对PGs对细胞膜破坏的抵抗能力要明显高于非转基因苗。