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1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是一种多羟基哌啶类生物碱，具有D-葡萄糖类似结构，可以竞争性抑制α-糖苷酶活性。1-DNJ及其衍生物具有很高的药用价值，不仅可应用于非胰岛素依赖性糖尿病和高歇氏病等疾病的治疗，同时还具有拮抗病毒感染及抑制肿瘤转移等生理活性。在自然界中1-DNJ主要存在于桑等植物中，在浅紫灰链霉菌及几种芽孢杆菌中也有发现，但均含量极低。 目前已有报道在几株芽孢杆菌中的TYB基因簇负责1-DNJ生物合成的前三步反应，TYB基因簇包含gabT1、yktc1及gutB1基因，并推测分别编码转氨酶(GabT1)、磷酸酶(Yktc1)及氧化还原酶(GutB1)。将TYB基因簇克隆到大肠杆菌中可实现1-DNJ在大肠杆菌中的合成，但仍含量极低。为快速优化1-DNJ的生物合成途径以提高1-DNJ在微生物中的合成量，针对1-DNJ建立一种高通量筛选方法势在必行。 本研究首次发现1-DNJ/MJ具有对来源于古菌硫磺矿硫化叶菌的β-糖苷酶LacS的抑制活性，并利用这一特性建立了一种可以在琼脂平板上通过颜色表征进行筛选的高通量筛选方法。将lacS基因插入到E.coli BW25113中，构建表达宿主菌BWlacS，后者因LacS的表达而在添加X-GAL的平板上生长时菌落呈现蓝色，在此菌株内同时表达来源于芽孢杆菌的TYB基因簇则由于合成的1-DNJ抑制了LacS的水解活性而使菌落呈现浅蓝色。当表达针对TYB基因簇构建的突变文库时，因不同突变体合成1-DNJ的能力不同造成对LacS的抑制程度不同，使菌落呈现蓝白不一的颜色表型，1-DNJ合成量越高则菌落颜色越白，因此从菌落的颜色表征可以达到对细胞内1-DNJ合成量进行筛选的目的。在此基础上，本研究对1-DNJ在微生物中的合成途径进行了两方面的改造。 一、针对合成途径中的关键酶GutB1构建易错突变文库，并利用所构建的高通量筛选方法进行筛选，得到一株突变体Gu30(GutB1 I236V)，其1-DNJ的摇瓶合成量提高了54％。对GutB1野生型及I236V突变体的酶活力进行分析，发现I236V突变体对1-DNJ生物合成途径中GutB1的底物2-氨基-2-脱氧-D-甘露醇(ADM)的酶活力为野生型的两倍。因此，关键酶GutB1活力的提高使得突变体菌株1-DNJ产量提高。本研究也对GutB1野生型及I236V突变体对底物ADM和NAD+进行酶动力学分析，发现I236V突变体对NAD+的亲和力显著高于野生型GutB1，且对两个底物的催化效率均较野生型有显著提高。 二、通过对TYB基因簇不同基因间的RBS区建立突变文库并进行筛选，对TYB基因簇中不同酶的表达通量进行优化，筛选得到一株1-DNJ合成量提高68％的突变体M13。实验巧妙的利用了融合表达sfGFP的方法对M13中Yktc1及GutB1的表达量变化进行分析，发现Yktc1在M13中表达水平仅为野生型的1/3，而GutB1的表达水平变化不大。因此，通过优化生物合成途径中不同酶的表达通量可以提高终产物1-DNJ的产量。