论文部分内容阅读
心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）的患病率和死亡率目前处在一个不断上升的状态中。CVD所带来的经济和社会等疾病负担越来越重,已经严重降低了CVD患者及其家庭的生活水平和质量。冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease,CHD）,简称冠心病,是CVD最重要的组成部分,也是导致CVD患者死亡的常见原因。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是几乎所有CHD的共同土壤,也是CHD重要的病理学基础和特征。AS的发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明清楚,遗传、环境、应激、脂代谢紊乱和感染等诸多因素均涉及到其发病机制。因此探讨AS的发病机理,寻找防治AS的新靶点,对CVD的防治和提高人们的健康水平具有重要意义。泡沫细胞（foam cells）的产生是AS早期的重要的病理特征。血管平滑肌细胞（VSMC）和巨噬细胞,在血管内膜下过量地吞噬脂蛋白源性的胆固醇,特别是氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）,导致脂质在巨噬细胞和VSMC内大量堆积,进而细胞泡沫化。LDL主要被巨噬细胞和VSMC膜上的CD36和SR-A等受体识别并大量无限制的摄取。摄取后的脂质可被巨噬细胞和VSMC代谢降解并将他们转运到细胞外,转运到肝脏,最终由肝脏分泌胆汁的形式排到肠道,从而达到抗AS的效应,这一过程被称为胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport,RCT）。巨噬细胞和VSMC的RCT主要有3条途径,即三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1,ABCA1）、三磷酸腺苷结合盒转运体G1（ATP binding cassette transporter G1,ABCG1）和B族Ⅰ型清道夫受体（scavenger receptor B type I,SR-B1）。RCT的异常是泡沫细胞产生及最后AS形成的重要原因。蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases,PRMT）是一种普遍存在于真核生物细胞中甲基化酶,主要参与蛋白质的精氨酸甲基化修饰。目前已经发现有9种PRMTs在哺乳动物的细胞中表达,而PRMT2是PRMTs的重要家族成员之一。PRMT2在人体各组织中均有表达,而在心脏、血管、卵巢、乳腺和神经系统等器官组织中的表达水平相对较高。PRMT2的生物学功能主要包括参与RNA的代谢过程,通过甲基化组蛋白,作为共激活因子,与多种核蛋白产生相互作用,参与基因的转录调控。最近的研究结果发现与非糖尿病小鼠相比,糖尿病小鼠的单核细胞中PRMT2表达降低,在高血糖条件下PRMT2的表达下调。敲除小鼠PRMT2基因后,小鼠的原代骨髓源性巨噬细胞中ABCA1的表达显著下调,而ABCA1介导的骨髓源性巨噬细胞胆固醇流出率也显著减少。这些研究也表明PRMT2可参与调控巨噬细胞的RCT,进而可能会影响泡沫细胞的产生,因此PRMT2可能是抗AS的潜在靶点,具有抗AS的作用。但是PRMT2的抗AS作用没有得到明确的证实,其详细的机制也还不清楚。因此本研究首先从CHD的临床病例中探讨血清PRMT2的水平与CHD的关系,进一步在体内的实验中观察高表达PRMT2对apo E-/-小鼠的高脂诱导的AS形成以及泡沫细胞中RCT的关键蛋白ABCA1、ABCG1和SR-B1及胆固醇摄取关键蛋白SR-A1和CD36表达的影响,阐明PRMT2抗AS的可能机制。第一章血清蛋白质精氨酸甲基转移酶2浓度与人冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系目的:探讨人冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary atherosclerotic heart disease,CHD）患者的血清蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase 2,PRMT2）浓度与CHD的经典危险因素以及CHD的病变程度之间的关系。方法:该研究的CHD组为在从2017年9月至2019年9月之间在南华大学附属第一医院住院治疗并进行冠状动脉造影术（coronary angiography,CAG）检查而确诊为CHD的患者110例。对照组为同期在南华大学附属第一医院住院治疗,冠状动脉造影检查阴性,而年龄和性别相匹配的患者110例。采用问卷调查和体格检查收集两组患者的基本情况和资料。收集患者和志愿者的血液标本,检测血糖、血脂水平及血清PRMT2浓度。对CHD患者血清PRMT2浓度与CHD的经典危险因素以及CHD的病变程度之间进行相关分析和回归分析。结果:1.对照组的人群和CHD组的患者中年龄大于或等于60岁的人所占百分率、男性所占百分率以及心率之间的差异均没有统计学意义（均P>0.05）。与对照组相比较,CHD组患者有饮酒史、吸烟史、高血压病史以及糖尿病病史的人群所占百分率均显著性增加,差异有统计学意义（均P<0.05）。2.与对照组相比较,CHD组患者的空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、体质指数（body mass index,BMI）、收缩压（systolic blood pressure,SBP）和舒张压（diastolic blood pressure,DBP）及血清的总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）的浓度均显著性增加,差异均有统计学意义（均P<0.05）。与对照组比较,CHD组患者的血清高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）和PRMT2浓度明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。3.CHD患者的血清PRMT2浓度与患者的BMI、血清TG、血清TC和血清LDL-C浓度等CHD的经典危险因素呈现显著的负相关（均P<0.05）,而与血清HDL-C的浓度呈现显著的正相关（P<0.05）,与DBP、SBP和FBG均无明显相关性（均为P>0.05）。4.CHD患者血清PRMT2浓度与CHD的Gensini积分呈现显著负相关（r=-0.63,P<0.05）;随着患者的Gensini积分的增加,患者的血清PRMT2浓度明显降低,差异有统计学意义（均P<0.05）。5.单因素logistic回归分析的结果表明CHD的血清PRMT2浓度的降低可能是CHD的危险因素（OR=0.51,95%CI:0.28～0.62,P<0.05）。多因素logistic回归分析在校正高血压、血脂水平的异常和2型糖尿病等CHD的经典危险因素以及年龄和性别以后,CHD患者的血清PRMT2浓度每增加1个标准差,CHD的发生风险降低36%（OR=0.47,95%CI:0.37～0.83,P<0.05）。小结:CHD患者的血清PRMT2浓度的降低与CHD发生风险的增加呈现独立相关性,CHD患者的血清PRMT2浓度与CHD患者的冠脉病变程度呈负相关。血清的PRMT2浓度有望成为CHD的风险评估和冠脉病变程度评估的指标。第二章PRMT2对鼠源巨噬细胞性泡沫细胞形成的影响及相关机制目的:观察高表达PRMT2对ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响并其探讨可能的作用机制。方法:1.将高表达PRMT2的慢病毒载体LV-PRMT2和对照慢病毒载体GV492分别转染RAW264.7巨噬细胞,用4.0μg/m L嘌呤霉素处理巨噬细胞4周,筛选阳性克隆细胞,建立稳定高表达PRMT2的巨噬细胞株。2.用ox-LDL（50μg/m L）处理巨噬细胞48 h,诱导细胞产生泡沫化。3.实验分为6组:正常对照组、ox-LDL组、空载体组、高表达PRMT2组、空载体+ox-LDL组、高表达PRMT2+ox-LDL组。4.通过油红O染色观察细胞内脂质的蓄积情况,高效液相色谱法测定细胞内TC、游离胆固醇（free cholesterol,FC）和胆固醇酯（cholesteryl ester,CE）的水平,用[3H]标记的胆固醇检测巨噬细胞的胆固醇外流率。5.采用Real-time PCR检测巨噬细胞中PRMT2 m RNA的表达水平,采用Western blot检测巨噬细胞中ABCA1、ABCG1、SR-B1、CD36和SR-A1的蛋白表达水平。结果:1.与正常对照组相比较,ox-LDL组巨噬细胞中PRMT2的m RNA和蛋白的表达水平均显著性降低,差异具有统计学意义（均P<0.05）。2.与空载体组相比较,高表达PRMT2组巨噬细胞中PRMT2的m RNA和蛋白的表达水平均显著性上调,差异具有统计学意义（均P<0.05）。3.Ox-LDL组和空载体+ox-LDL组的巨噬细胞中均发现有大量的脂滴存在,而与空载体+ox-LDL组相比较,高表达PRMT2+ox-LDL组细胞内的脂滴明显减少,荷脂情况明显减轻。4.与空载体+ox-LDL组相比较,高表达PRMT2+ox-LDL组巨噬细胞中的TC、FC、CE和CE/TC水平显著性降低,差异具有统计学意义（均P<0.05）。5.与空载体+ox-LDL组相比较,高表达PRMT2+ox-LDL组巨噬细胞胆固醇的流出率显著增加,差异具有统计学意义（均P<0.05）。6.与空载体+ox-LDL组相比较,高表达PRMT2+ox-LDL组巨噬细胞中ABCA1的蛋白表达水平显著性增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。高表达PRMT2+ox-LDL组与空载体+ox-LDL组巨噬细胞中ABCG1、CD36、SR-A1的表达水平无显著性差异,差异没有统计学意义（均P>0.05）。小结:高表达PRMT2抑制了ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,其机制可能与上调巨噬细胞中ABCA1的表达,促进其介导的胆固醇的流出有关。第三章PRMT2对apo E-/-小鼠AS形成的影响及相关机制目的:探讨高表达PRMT2对Apo E-/-小鼠AS形成的影响及其相关的机制。方法:1.雄性Apo E-/-小鼠,10周龄,随机分为三组,每组10只（n=10）。AS组:高脂饲料喂养小鼠12周;AS+空载体组:转染慢病毒载体GV492 24 h后,高脂饲料喂养小鼠12周,在第一次注射慢病毒载体GV492后14天,第二次尾静脉注射慢病毒载体GV492。AS+PRMT2组:转染PRMT2高表达的慢病毒载体LV-PRMT2 24 h后,高脂饲料喂养小鼠12周,在第一次注射LV-PRMT2慢病毒载体后的第14天,第二次尾静脉注射LV-PRMT2慢病毒载体。2.到达实验终点,将小鼠麻醉固定,通过心脏放血处死动物,收集其血液标本。检测血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平。3.收集并培养Apo E-/-小鼠的腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages,PM）,通过[3H]标记的胆固醇测定其胆固醇的流出率。4.取Apo E-/-小鼠的主动脉根部,作连续冰冻切片,进行主动脉窦的油红O染色、H-E染色和Masson染色观察主动脉窦的AS形态学变化。5.采用Real-time PCR和Westewrn blot分别检测小鼠的主动脉组织和腹腔巨噬细胞中PRMT2的m RNA和蛋白的表达。Westewrn blot分别检测小鼠的血管组织和PM中ATP结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1,ABCA1）、ATP结合盒转运体G1（ATP binding cassette transporter G1,ABCG1）、清道夫受体B1（scavenger receptor B1,SR-B1）、清道夫受体A1（scavenger receptor B1,SR-A1）和CD36蛋白的表达。结果:1.构建PRMT2高表达的慢病毒载体LV-PRMT2,对照载体是慢病毒载体GV492。2.第一次慢病毒载体尾静脉注射后从第3天开始一直到实验结束的第84天小鼠PM中PRMT2 m RNA和蛋白的表达水平与没有注射病毒时（0天）的表达水平相比较均显著性上调,差异具有统计学意义（均P<0.05）。3.与AS+空载体组比较,AS+PRMT2组小鼠主动脉中PRMT2m RNA和蛋白的表达均显著性上调,差异具有统计学意义（均P<0.04）。而AS+空载体组和AS对照组比较小鼠主动脉中PRMT2m RNA和蛋白的表达没有显著性差异,差异没有统计学意义（均P>0.05）。4.AS+空载体组和AS+PRMT2组小鼠的体重在实验开始和实验结束时均没有显著性差异,差异没有统计学意义（均P>0.05）。5.与AS组比较,AS+空载体组小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平没有显著性差异,差异没有统计学意义（均P>0.05）。与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠血清的TG、TC和LDL-C得水平均显著性降低,差异具有统计学意义（均P<0.05）,血清HDL-C的水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.H-E染色结果显示AS组和AS+空载体组小鼠主动脉窦可见明显的AS病变,而AS+PRMT2组小鼠主动脉窦AS病变明显减轻。油红O染色结果显示AS组和AS+空载体组小鼠主动脉窦可见明显的AS病变,而AS+PRMT2组小鼠主动脉窦AS病变明显减轻,与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠主动脉窦AS病变面积百分率显著性降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。7.Masson染色结果显示:与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠主动脉窦AS斑块中胶原水平显著性增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠的腹腔巨噬细胞胆固醇流出率显著性增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。而AS+空载体组和AS对照组比较,小鼠的PM胆固醇流出率没有显著性差异（均P>0.05）。9.与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠的主动脉和腹腔巨噬细胞中ABCA1的表达显著性上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。而与AS+空载体组相比较,AS+PRMT2组小鼠的主动脉和腹腔巨噬细胞中ABCG1、SR-B1、SR-A1和CD36的表达均没有显著性差异（均P>0.05）。小结:高表达PRMT2抑制了高脂喂养的Apo E-/-小鼠AS的形成,其机制可能与上调ABCA1的表达,促进细胞的胆固醇流出有关。总之,我们的研究结果表明CHD患者的血清PRMT2水平的降低与CHD发生风险的增加呈现独立相关性,CHD患者的血清PRMT2水平与CHD患者的病变程度呈负相关。血清的PRMT2水平有望成为CHD的风险评估和病变程度评估的指标。高表达PRMT2抑制了高脂喂养的Apo E-/-小鼠AS的形成以及ox-LDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,其机制可能与上调巨噬细胞中ABCA1的表达,促进其介导的胆固醇的流出有关。