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目的：
1.了解广州地区临床分离铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对常用抗菌药物的耐药状况。
2.明确广州地区质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因在铜绿假单胞菌中的流行状况并分析其与耐药之间的关系。
3.探讨gyrA、parC基因突变与铜绿假单胞菌对喹诺酮类抗菌药物耐药之间的关系。
方法：
1.收集广州地区2005-2007年间临床分离的铜绿假单胞菌，使用VITEK-32型微生物鉴定系统对菌株重新鉴定；采用K-B纸片琼脂扩散法按照CLSI抗菌药物敏感性试验执行标准进行药敏试验，获取耐药信息。
2.使用两组多重PCR反应对所有铜绿假单胞菌中的PMQR基因进行检测，一组检测qnrA、qnrB、qnrS、qnrC和qnrD，另一组检测aac(6)-Ib和qepA，设计针对各基因变异体共有区域的特异性引物并依照多重PCR的要求优化反应条件；多重PCR扩增出目的片段者使用相应引物单独进行PCR，对扩增产物测序并与Genbank数据库比对以确定其亚型。
3.采用连续琼脂扩散法体外模拟4株铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药进化过程；分别设计特异性引物，PCR扩增所得菌株gyrA和parC的QRDR并测序分析有无突变、突变位点及由此导致的氨基酸改变；将诱导耐药的铜绿假单胞菌无药连续培养15代，K-B纸片琼脂扩散法测定每一代细菌的抑菌圈直径，PCR扩增第15代铜绿假单胞菌gyrA和parC的QRDR并测序，以观察体外诱导耐药的铜绿假单胞菌在表型及基因上的稳定性；
4.在14株临床分离环丙沙星耐药株中PCR扩增gyrA和parC的QRDR，对扩增产物测序分析，并与体外诱导耐药株的突变进行比较。
结果：
1.经过重新鉴定，共得到212株铜绿假单胞菌，其中148株(69.8％)分离自痰标本；药敏试验结果显示，平均耐药率超过30％的抗菌药物有2种，分别是庆大霉素42.9％(91/212)和阿米卡星33.0％(70/212)，环丙沙星和左氧氟沙星的平均耐药率分别是10.8％(23/212)和19.3％(41/212)，所有9种抗菌药物的耐药率均高于10％；2005-2007年间铜绿假单胞菌的多重耐药率为26.4％(56/212)；环丙沙星和左氧氟沙星与庆大霉素、亚胺培南的共同耐药率超过69％，而对环丙沙星耐药的菌株100％对左氧氟沙星耐药。
2.在212株铜绿假单胞菌中通过PCR扩增及测序共有4株(1.9％)检出qnr基因，分别是qnrB阳性2株(0.9％)，qnrS阳性1株(0.5％)，aac(6)-Ib-cr阳性2株(0.9％)，其中1株细菌同时检出qnrB与aac(6)-Ib-cr基因，但是这4株细菌中仅有1株对左氧氟沙星表现为耐药。其他质粒介导的耐药基因qnrA、qnrC、qnrD、qepA均未检出。
3.经过15轮体外连续诱导4株铜假单胞菌均成为环丙沙星耐药株，在该过程中4株细菌gyrA基因的QRDR均发生突变，突变的氨基酸位点包括Ala67→Ser，Asp72→Gly，Gly75→Ala，Thr83→Ile，Asp87→Tyr，其中1株为双突变，另外3株为单点突变；parC基因的QRDR均未发现突变；经过15轮连续的无药培养，4株耐药铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药性及基因突变均保持稳定，无回复突变发生；对基因突变发生时间点的分析表明，铜绿假单胞菌在3代的诱导后即进入中介区，在进入中介区时即有突变发生，且随着耐药程度的加剧会发生第2个位点的突变。
4.通过对14株临床分离环丙沙星耐药株gyrA与parC基因QRDR的PCR扩增产物测序发现，所有菌株的gyrA基因均发生单点突变，导致GyrA Thr83→Ile、Asp87→Tyr，其中有2株还同时发生parC基因单点突变，导致ParC Ser87→Leu；与体外诱导耐药的铜绿假单胞菌相比，临床分离耐药株GyrA的突变位点较少，两者均有GyrAThr83→Ile、Asp87→Tyr突变，而体外诱导耐药株无parC突变发生。
结论：
1.2005-2007年间广州地区的铜绿假单胞菌多重耐药严重。
2.广州地区铜绿假单胞菌中已携带有PMQR基因，且敏感菌株中也有该类基因存在。
3.gyrA基因QRDR突变与铜绿假单胞菌对喹诺酮类的耐药密切相关；GyrA最主要的突变方式是Thr83→Ile。