随着人口老龄化及平均寿命延长,心房颤动(Atrial Fibrillation, AF)的发病率越来越高,其对人群死亡率、致残率的影响非常显著。预计2020年我国人口将达到14.5亿,60岁以上老年人约占人口总数20%,医务工作者面临艰巨的房颤预防和治疗工作。近年心房颤动研究进展迅速,药物治疗和导管射频消融术取得了一定进步,但许多患者治疗效果不佳,因此必须进一步深入研究其发病机制,寻求新的治疗途径。房颤的始动因素很多,随着房颤持续时间延长,心房电生理和细胞特性发生改变使房颤得以持续,这一过程称为电重构,主要特点包括动作电位时限(APD)和心房有效不应期(ERP)缩短及离散度增加,频率适应性降低,心房传导速度减慢使心房波长缩,使房颤易于诱发及稳定性增加。而心房不应期和动作电位的缩短,与内向离子流(Ca2+或Na+)净减少,外向离子流(K+)净增加,缝隙连接减少密切相关。心房电重构发生的基础就是离子通道的损伤或者功能改变,其机制复杂,早期研究认为心钠素、心房肌缺血与ATP敏感性钾通道、自主神经系统、钙超载和代谢紊乱可能是房颤电重构的触点,近年来人们将注意力集中于氧化应激和损伤的途径上。多项研究证实AF患者右心耳组织、血浆中的高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)较窦性心律组明显升高,TNF-α血清浓度在阵发性、持续性和永久性房颤中呈进行性递增,认为氧化应激和炎症可直接导致房颤的病理生理改变。动物实验发现TNF-α可影响到大鼠心室肌L型钙电流、CX40,对其它离子通道及缝隙链接作用不明确。炎症因子TNF-α IL-6、IL-4参与激活和调节JAK-STAT信号通路,JAK-STAT信号通路可上调环氧化酶(COX-2)、一氧化氮合酶(NOS2)、血管内皮生长因子(VEGF)、抗氧化剂锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、金属硫蛋白(MT1a nd MT2)、基质金属蛋白酶(MMP)等,从而影响心肌肥厚和心肌重构。研究发现藜芦醇通过阻断JAK/STAT1通路从而达到控制干扰素介导的巨噬细胞迁徙,能降低炎症反应对血管的损害,降低动脉血栓和斑块的形成。在STAT3基因敲除小鼠中发现心脏间质纤维化增加,TNF-α分泌增多,心肌扩张和心功能受损；敲除STAT3基因或者使用JAK2抑制剂AG490降低STAT3表达,可使心肌梗死面积增大；Adawi研究发现大鼠心肌梗死模型中,予AG490后Kv4.3mRNA表达增加,可见JAK-STAT信号通路是参与了多种心血管疾病的病理生理。本研究通过观察TNF-α慢性刺激HL-1细胞,探讨TNF-α对部分离子通道及缝隙连接的影响,JAK-STAT信号通路在炎症因子TNF-α作用下,参与调节电重构的机制。本实验分两部分。第一部分TNF-α对HL-1心房肌细胞电重构的影响目的：TNF-α参与冠心病、心力衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病的多种心血管疾病病理过程,但在房颤发病机制中的作用尚不清楚。本部分实验通过不同浓度TNF-α刺激HL-1细胞后,通过检测电重构相关的基因,探讨TNF-α对HL-1细胞电重构的影响。方法：TNF-α25ng/ml、50ng/ml刺激HL-1细胞24小时后,提取总RNA和总蛋白,使用Real-time PCR(RT-PCR)检测CACNA1c、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、 GJA5、GJA1、SLC8A1的mRNA表达,用蛋白印迹法(Western bloting)测定CAV1.2和ERG的表达,并用膜片钳方法记录对照组和实验组Ica,L、IKR电流和APD。采用pCLAMP10.2软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换,Prism3.0软件对数据进行曲线拟合及绘制离子通道电流密度及APD,电流密度(pA/pF)=电流强度/电容。所有数据用均数±标准差(Mean±SD)表示,mRNA比较采用one-way ANO VA方法检验,采用LSD方法进行两两比较。IcaL、Ikr、 APD采用两独立样本t检验。用SPSS13.0统计软件分析,以P<0.05为有统计学意义。结果：RT-PCR发现1、CACNAlc mRNA水平随着TNF-a浓度的增加而减少,对照组与实验组有显著差异(p<0.01),而实验组TNF-a50ng/ml组也明显低于25ng/ml (p<0.01)。2、KCNJ2mRNA水平随着TNF-a浓度的增加而增加,但对照组与25ng/ml组无明显差别,与50ng/ml有显著差异(p<0.05),实验组之间无显著差别。3、KCNH2mRNA实验组显著高于对照组(p<0.05),但实验组之间无显著差别。4、KCNQ1mRNA实验组与对照组之间无显著差异。5、GJA5mRNA实验组与对照组之间无显著差异。6、GJA1mRNA水平随着TNF-a浓度的增加而增加,但对照组与25ng/ml组无明显差别,对照组、25ng/ml组与50ng/ml有显著差异(p<0.05)。7、SLC8A1mRNA水平随着TNF-a浓度的增加而增加,对照组与25ng/ml组、50ng/ml组有显著差异(p<0.05和p<0.01),实验组25ng/ml组与50ng/ml之间也有显著差异。蛋白印迹法发现钙离子通道CAV1.2随着TNF-a浓度增加而减少,钾离子通道ERG随着TNF-a增加而增加。通过膜片钳检测发现与对照组相比,TNF-a组L型钙通道离子电流密度减少,电流密度在指令电位-10mv、0mv、10mv、20mv、30mv、40mv明显下降有显著差。与对照组相比,TNF-α组快速激活延迟整流钾电流平台期和尾电流的电流密度增加,平台期电流密度在指令电位-40、-30、-20、-10、30、40、50mv有显著差异,30、40、50mv时明显升高。与对照组相比,TNF-α组APD则缩短APDso缩短43.6%,APD90缩短40%,APD50-APD90缩短37.9%有显著差异。结论：TNF-α可改变HL-1细胞的CACNA1c、KCNJ2、KCNH2、GJA1、 SLC8A1的mRNA表达,减少CAV1.2和ERG蛋白表达,减少L型钙通道离子电流、增加快速激活延迟整流钾电流电流和缩短APD, TNF-α对心房肌细胞的电重构中有重要作用。第二部分Jak-Stat信号通路对ERG的作用目的：Jak-Stat信号通路是细胞因子刺激的信号转导通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程,在心脏发育、心肌肥厚和心肌纤维化发挥重要作用。TNF-α通过TNFR2激活Jak-Stat信号通路,在房颤电重构的作用尚不清楚。本部分研究初步探讨TNF-α刺激HL-1心房肌细胞后,Jak-Stat信号通路会对其电重构是否产生影响。方法：不同浓度TNF-α刺激HL-1细胞24小时后,用蛋白印迹法检测JAK1、 STAT3表达,siRNA敲除STAT3,用蛋白印迹法检测STAT3和ERG水平,同时用膜片钳方法观察对照组和实验组(siRNA-STAT3) IKR电流和APD。所有数据用均数±标准差(Mean±SD)表示,Ikr、APD采用两独立样本t检验。用SPSS13.0统计软件分析,以P<0.05为有统计学意义。结果：蛋白印迹法发现TNF-α0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml,慢性刺激24小时后,JAK1和STAT3表达增多。予siRNA48小时,加入TNF-a24小时后,siRNA-negative组的STAT3和ERG明显高于siRNA-STAT3-1组、3iRNA-STAT3-2组、siRNA-STAT3-3组、siRNA-STAT3-pool组,STAT3和ERG表达减少。膜片钳观察发现与对照组相比,siRNA组快速激活延迟整流钾电流平台期和尾电流的电流密度减少,平台期电流密度在指令电位-30、30、40、50mv有显著差异,30、40、50mv时明显减低,尾电流电流密度在指令电位-30、-20、-10、10、20、30、40、50mv明显减低,有显著差异。与对照组相比,siRNA组APDso延长69%,APD90延长60%,APD50-APD90延长57.1%。我们通过t检验,发现siRNA组平台期电流密度、尾电流电流密度与正常细胞的相比明显下降,APD50、APD90仍短于正常细胞,但无统计学差异。结论：TNF-α可使HL-1细胞JAK1和STAT3表达增加,而抑制siRNA后明显减少ERG表达和降低快速激活延迟整流钾电流平台期和尾电流的电流密度,并低于无干预的HL-1细胞,同样能使APD50和APD90接近与无干预的HL-1细胞,说明STAT3对ERG是有影响的,并在TNF-α对HL-1细胞电重构的过程中起到作用,提示将来可能作为房颤治疗的一个靶点。