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抑郁症是一种常见的精神疾病,发病机制尚不明确,治疗也是难题。小胶质细胞的激活被认为是导致包括抑郁症在内的各种神经系统疾病的重要步骤。经典激活的M1型小胶质细胞有促炎作用,可对神经元造成损害,替代激活的M2型小胶质细胞有吞噬、抗炎及神经营养的作用,自噬与M2型小胶质细胞的激活密切相关。机体受到应激刺激后,外周免疫系统诱导细胞因子向中枢神经系统转运,刺激小胶质细胞活化;另一方面,激活的小胶质细胞分泌多种促炎细胞因子和其他炎症介质对邻近神经元造成损害。小胶质细胞自噬调节细胞因子的产生和分泌,并能消除积聚和侵袭的病原体,是实现最佳免疫功能的关键。叉头蛋白O3a（Forkhead box O3a,FOXO3a）信号转导在小胶质细胞自噬调节中起关键作用,是PI3K/AKT下游自噬调控的关键分子。微管相关蛋白轻链3B（Microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B）是自噬特异性蛋白,参与并调节自噬体的形成,是反应自噬活性的标志性蛋白,自噬相关蛋白5（Autophagy associated gene,ATG5）已经被证明是规范自噬的一个重要组成部分,其沉默完全抑制自噬。化浊解毒疏肝方是基于浊毒理论并通过多年临床实践与科研实验创立的自拟方,本课题组前期临床试验与动物实验充分证明化浊解毒疏肝方具有明确的抗抑郁效果。本研究旨在探索小胶质细胞自噬及其表型转换在抑郁症发病中的作用,以探究抑郁症可能的发病机制;在此基础上,探究化浊解毒疏肝方的抗抑郁作用机制,为其抗抑郁的科学内涵提供新依据。第一部分化浊解毒疏肝方通过PI3K/AKT/FOXO3a介导自噬调控小胶质细胞表型进而改善CUMS诱导的抑郁样行为目的:课题组前期研究充分证明化浊解毒疏肝方能改善慢性不可预见性温和应激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）小鼠抑郁样行为,本部分课题通过研究PI3K/AKT/FOXO3a通路对自噬的调控,观察小胶质细胞表型转变及炎性因子水平,探究化浊解毒疏肝方对CUMS小鼠的抗抑郁样行为机制。方法:选用60只ICR雄性小鼠,分为正常组、模型组、氟西汀组、化浊解毒疏肝方高剂量组、化浊解毒疏肝方低剂量组,建立CUMS模型,通过行为学测试小鼠抑郁状态。酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）小鼠海马组织炎性因子IL-1β、TNFα观察炎性反应水平;蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测PI3K/AKT/FOXO3a通路相关蛋白及自噬相关蛋白LC3B、ATG5的表达;免疫荧光检测FOXO3a观察核转位情况,检测Iba-1观察小胶质细胞激活状态;实时荧光定量PCR（Real-Time PCR,RT-PCR）检测反应小胶质细胞激活状态的M1表型marker（i NOS、IL-1β）和M2表型marker（Ym1/2、Arg-1）,尼氏染色观察海马神经元受损情况。结果:1.CUMS模型小鼠一般情况、糖水偏爱实验、悬尾实验、旷场实验结果均符合抑郁样行为学表现,造模成功,水迷宫表现出学习记忆能力下降。药物治疗后抑郁样行为改善,学习记忆能力提高。2.ELISA显示CUMS小鼠海马区炎性因子升高,WB结合免疫荧光显示PI3K/AKT受到抑制,其下游的FOXO3a去磷酸化后表达增强并发生核转位,自噬相关蛋白LC3B、ATG5表达增强,RT-PCR结合免疫荧光显示海马区小胶质细胞以表达M1表型为主。药物治疗后炎性因子下降,PI3K/AKT激活,FOXO3a磷酸化后表达降低,自噬相关蛋白表达降低,海马区小胶质细胞以表达M2表型为主。3.尼氏染色显示CUMS组小鼠海马CA3、DG区神经元数量减少,尼氏小体减少,神经元受损,药物治疗后神经元得到修复。小结:1.CUMS可成功诱导小鼠产生抑郁样行为,并伴有学习记忆能力下降,其机制可能是抑制PI3K/AKT促使FOXO3a去磷酸化,从而增强自噬,调控小胶质细胞向M1型转变,促进炎性反应,损伤神经元,引起抑郁样行为。2.化浊解毒疏肝方可能通过激活PI3K/AKT并促进FOXO3a磷酸化来抑制过度自噬,从而调控小胶质细胞向M2型转变,缓解炎性反应,保护神经元,改善CUMS诱导的抑郁样行为。第二部分化浊解毒疏肝方通过PI3K/AKT/FOXO3a介导自噬调控小胶质细胞表型进而改善LPS诱导的抑郁样行为目的:注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能够诱导炎症反应并使动物表现出抑郁样行为,LPS还可激活小胶质细胞。LY294002是一种常用的PI3K抑制剂,也是一种自噬抑制剂。本部分课题探讨化浊解毒疏肝方对LPS刺激小鼠行为学的影响,并研究PI3K/AKT/FOXO3a通路对小胶质细胞的自噬调控,及自噬对小胶质细胞表型转变与炎性因子水平变化的影响,探究化浊解毒疏肝方的作用机制。方法:1.体内实验:选用60只ICR雄性小鼠,分为正常组、模型组、氟西汀组、化浊解毒疏肝方组、LY294002抑制剂组,腹腔注射建立LPS模型,通过行为学测试小鼠抑郁状态。ELISA检测小鼠海马组织炎性因子水平;WB检测PI3K/AKT/FOXO3a通路相关蛋白及自噬相关蛋白LC3B、ATG5的表达;免疫荧光检测Iba-1;RT-PCR检测M1、M2表型marker。2.体外实验:选用小鼠小胶质细胞（BV2）,分为空白对照组、模型组、含药血清实验组、LY294002抑制剂组、含药血清对照组,建立LPS模型并给予含药血清及LY294002干预,通过ELISA检测炎性因子,WB检测PI3K/AKT/FOXO3a通路相关蛋白及自噬相关蛋白表达,RT-PCR检测小胶质细胞M1、M2表型marker。结果:1.LPS模型小鼠一般情况、糖水偏爱实验、悬尾实验结果均符合抑郁样行为学表现,造模成功,药物治疗后抑郁样行为改善。2.体内实验ELISA显示LPS模型小鼠海马区炎性因子水平升高,WB显示PI3K/AKT激活,FOXO3a磷酸化,LC3B、ATG5表达降低,RT-PCR结合免疫荧光显示海马小胶质细胞以表达M1表型为主。药物治疗后炎性因子水平下降,PI3K/AKT抑制,FOXO3a去磷酸化,LC3B、ATG5表达升高,治疗组小鼠海马小胶质细胞以表达M2表型为主。抑制剂组小鼠海马区炎性因子水平偏高,PI3K/AKT通路抑制,FOXO3a磷酸化,LC3B、ATG5表达降低,海马区小胶质细胞以M1表型为主。3.体外实验ELISA显示LPS处理的BV2细胞炎性因子升高,WB显示模型组PI3K/AKT通路激活,FOXO3a磷酸化,LC3B、ATG5表达降低,RT-PCR显示LPS组BV2细胞以表达M1表型为主。含药血清实验组BV2细胞炎性因子降低,PI3K/AKT通路受到抑制,FOXO3a去磷酸化,LC3B、ATG5表达增强,以表达M2表型为主。抑制剂组BV2细胞炎性因子升高,PI3K/AKT通路抑制,FOXO3a磷酸化,LC3B、ATG5表达降低,以表达M1表型为主。小结:1.LPS可成功诱导小鼠产生抑郁样行为,其机制可能是激活PI3K/AKT促使FOXO3a磷酸化,从而抑制自噬,调控小胶质细胞向M1型转变,促进炎性反应,引起抑郁样行为。2.化浊解毒疏肝方可通过抑制PI3K/AKT并促进FOXO3a去磷酸化来增强自噬,从而调控小胶质细胞向M2型转变,缓解炎性反应,改善LPS诱导的抑郁样行为。3.化浊解毒疏肝方可通过抑制PI3K/AKT促使FOXO3a去磷酸化来增强小胶质细胞自噬,调控小胶质细胞向M2型转变,缓解LPS刺激引起的炎性反应。结论:1.化浊解毒疏肝方可改善CUMS和LPS诱导的抑郁样行为,并促进CUMS模型小鼠的神经元恢复,改善学习记忆能力。2.化浊解毒疏肝方可通过PI3K/AKT/FOXO3a通路双向调控小胶质细胞自噬水平,从而调控小胶质细胞向M2表型转换,缓解中枢炎症反应,改善CUMS和LPS诱导的抑郁样行为。