【摘 要】
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呕吐毒素（denoxynivalenol,DON）又称为脱氧雪腐镰刀菌稀醇,是由镰刀菌（Fusarium）产生的一种B型单端孢霉烯族毒素（Type B Trichothecenes）。DON是全球污染程度最广的霉菌毒素之一,广泛污染饲料和谷物,严重威胁人类及动物的健康。急性DON中毒会引起动物呕吐和腹泻,而长期低剂量DON的暴露则引起动物厌食、生长缓慢、免疫毒性和影响生殖和发育等症状。目前发现,D
【基金项目】
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广东省教育厅（No.2018KZDXM015、2017KCXTD001）； 广州市科技计划（No.201804020067）； 广东省自然科学基金（No.2015A030312005）； 国家自然科学基金与广东省联合基金（No.U1901207）；
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呕吐毒素（denoxynivalenol,DON）又称为脱氧雪腐镰刀菌稀醇,是由镰刀菌（Fusarium）产生的一种B型单端孢霉烯族毒素（Type B Trichothecenes）。DON是全球污染程度最广的霉菌毒素之一,广泛污染饲料和谷物,严重威胁人类及动物的健康。急性DON中毒会引起动物呕吐和腹泻,而长期低剂量DON的暴露则引起动物厌食、生长缓慢、免疫毒性和影响生殖和发育等症状。目前发现,DON的毒性在肾上腺、胸腺、胃、脾脏和结肠等许多组织器官被广泛研究,但它对脂肪组织的影响尚未报道。在研究DON毒理机制的过程中,我们观察到DON抑制成熟脂肪细胞形成和细胞对葡萄糖的吸收。通过分析与脂肪合成和糖吸收相关基因在DON影响下的表达变化,找出发挥作用的潜在靶基因,然后通过敲降或过表达验证其是否参与DON对脂肪合成和糖吸收的影响。最后从该基因表达是如何受到DON调控的角度出发,分别从组蛋白修饰和互作蛋白的表达调控,揭示DON抑制脂肪合成和糖吸收的分子机制,为探索DON对脂质稳态和糖代谢的毒理效应提供了理论参考。通过动物模型观察BALB/c小鼠在灌胃DON（3 mg/kg）后,与灌胃无菌水的对照组相比,HE染色观察小鼠附睾和肾周脂肪组织体积明显减小。甘油三酯试剂盒检测DON处理组TG含量也明显减少。在细胞水平作进一步验证,3T3-L1前细胞诱导分化为成熟脂肪细胞的过程中分别加入不同浓度的DON（100 ng/m L和200 ng/m L）处理,油红O染色结果表明DON明显抑制脂滴产生,TG试剂盒检测细胞中TG含量也明显减少,且DON对油滴和TG含量的抑制呈现剂量依赖性。PPARγ2是脂肪生成和脂肪组织发育的关键调控因子,DON处理BALB/c小鼠和3T3-L1细胞,RT-PCR表明Pparγ2的m RNA水平明显下调,且参与脂肪合成的基因C/ebpαm RNA水平明显下调,Western blot检测PPARγ2和C/EBPα蛋白水平也显著下调。此外,DON下调PPARγ2下游参与脂肪合成相关基因Fasn、Acaca、Fabp4和Cd36 m RNA和蛋白表达。过表达PPARγ2回复DON对PPARγ2下游靶基因和脂肪形成的抑制作用。值得注意的是,DON不影响早期脂肪形成的关键调节因子C/EBPβ和C/EBPδ的表达。因此,DON主要通过下调PPARγ2及下游基因的表达进而抑制中期和晚期脂肪的形成。为揭示DON影响PPARγ2表达的调控机制,主要从组蛋白修饰和翻译后修饰两个方面进行探讨。MAPK激活PPARγ2抑制PPARγ2的转录活性并降解PPARγ2的表达。而DON能够快速上调MAPK信号通路。我们在3T3-L1细胞中发现DON上调MAPK通路中的JNK和p38的磷酸化水平,但DON没有上调PPARγ2的磷酸化水平,说明DON抑制PPARγ2蛋白的表达不是通过MAPK通路。值得注意的是,Ch IP实验结果表明DON特异的抑制H3K4me2和H3K4me3在Pparγ2启动子区域的富集,而不影响这些组蛋白在Fabp4启动子区域的富集。由此我们提出DON是通过抑制组蛋白在Pparγ2启动子区域的富集从而抑制Pparγ2的转录活性,造成其下游靶基因的下调,最终抑制脂肪的形成过程。DON对抑制脂肪形成很可能影响机体的稳态,尤其是对葡萄糖的吸收和利用。2-NBDG法观察到DON抑制3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收,且呈现剂量依赖性。实验室前期结果表明DON抑制β-catenin表达。由此我们猜测DON通过抑制β-catenin影响细胞对葡萄糖的吸收。2-NBDG实验表明过表达β-catenin全长和突变体蛋白（激活型）的确促进细胞对葡萄糖的吸收。膜质分离实验表明和免疫荧光实验表明β-catenin全长和突变体蛋白促进GLUT4向细胞膜的富集。为进一步探究DON如何影响β-catenin促进细胞对葡萄糖的吸收,质谱结果显示β-catenin和参与调节葡萄糖吸收的重要蛋白TBC1D4互作,免疫共沉淀和GST-pull down实验表明β-catenin全长和突变体蛋白与TBC1D4互作。对TBC1D4的结构域进行截短发现β-catenin全长和突变体蛋白与TBC1D4的GAP结构域互作。而当TBC1D4第973位点的R突变为K后,TBC1D4的GAP结构域蛋白与β-catenin的互作明显减弱。此外,DON下调TBC1D4蛋白及其磷酸化水平。上述结果说明β-catenin/TBC1D4/GLUT4途径参与DON对葡萄糖吸收的抑制作用。综上所述,我们发现DON不仅通过抑制H3K4me2和H3K4me3在Pparγ2启动子区域的富集,下调PPARγ2及下游靶基因的表达,影响脂肪细胞的成熟,而且通过影响β-catenin/TBC1D4/GLUT4途径抑制细胞对葡萄糖的吸收。因此,本文揭示了DON对脂肪形成的葡萄糖吸收的影响及其可能存在的调控机制,这为进一步探究DON作用于动物细胞产生新的毒理效应及分子机制提供了一定的参考,增加对毒理学机理的认识。
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