神经母细胞瘤是儿童最常见的实体肿瘤之一,其恶性程度高、异质性高、易对化疗产生耐药性、易转移、易复发。但自行消退与体外诱导分化成熟的特点,使其成为研究肿瘤分化的较好的模型,阐释其增殖和分化的机制,能够为该肿瘤的治疗提供新策略。研究者发现异常的组蛋白甲基化修饰往往引起基因表达活性的改变,从而成为肿瘤发生的主要诱因之一。组蛋白甲基化转移酶SETDB1,主要催化H3K9me3甲基化,在多种类型的肿瘤细胞中高表达,包括非小细胞肺癌,小细胞肺癌,胶质瘤和前列腺癌等,下调其表达会抑制癌细胞的增殖分化以及侵袭转移能力。本研究探究组蛋白赖氨酸甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤细胞的增殖及分化的影响及其机制,揭示了SETDB1及其下游效应因子在母瘤增殖和分化过程中的重要作用,以期能为神经母细胞瘤的治疗提供新思路。以下是本论文主要发现:1.SETDB1参与神经母细胞瘤细胞增殖及分化的调控我们采用Western blot和荧光定量PCR技术检测到SETDB1蛋白在神经母细胞瘤细胞系中有普遍表达,接着利用慢病毒介导的shRNA干涉技术在细胞系BE(2)-C和SHEP1细胞系中对SETDB1的表达进行下调,CCK8实验检测结果显示SETDB1si细胞的生长受到明显抑制。软琼脂实验发现SETDB1si细胞的克隆形成能力明显下降。同时我们通过建立荷瘤鼠模型,发现SETDB1si细胞的体内成瘤能力降低。最后,我们通过Microarray分析,并采用荧光定量PCR技术,Western blot和细胞免疫荧光实验检测了BE(2)-C和SHEP1细胞系的分化情况,发现SETDB1si细胞向着胶质细胞发生分化。2.setdb1调控嘌呤代谢途径的关键酶基因prps1,而prps1也对神经母细胞瘤细胞增殖和成瘤有影响我们对setdb1si细胞进行了microarray分析,发现下调setdb1影响了细胞的嘌呤代谢相关途径。prps1是嘌呤代谢过程中的关键限速酶,我们利用westernblot和荧光定量pcr技术检测到在setdb1si的细胞中,prps1的表达也受到了抑制。接着我们对setdb1以及prps1的启动子进行了染色质免疫共沉淀实验,结果显示,setdb1以及h3k9me3均与prps1下游启动子676-859bp区域有显著结合,表明setdb1能够调控prps1基因的转录,我们推测setdb1可能通过调控prps1的表达来进一步影响细胞增殖。我们通过分析神经母细胞瘤临床预后数据库,发现prps1高表达会显著降低神经母细胞瘤患者的生存率,且prps1的表达水平与肿瘤患者的患病年龄、死亡原因、复发情况以及n-myc的表达量等相关。因此我们利用慢病毒介导的shrna干涉技术在细胞系be(2)-c和shep1细胞系中对prps1进行下调。首先我们利用westernblot和荧光定量pcr技术检测到prps1蛋白在神经母细胞瘤细胞系中有普遍表达,然后利用细胞增殖标记brdu进行免疫荧光染色实验检测prps1si后细胞的增殖情况,发现brdu阳性率明显降低,表明细胞的增殖受到抑制。cck8实验检测结果显示prps1si后细胞的生长受到明显抑制。流式细胞仪分析prps1si的细胞周期,发现细胞周期阻滞于g1期。软琼脂实验发现prps1si细胞的克隆形成能力显著降低,细胞的自我更新和增殖活性受到明显抑制。最后我们通过建立荷瘤鼠模型,发现prps1si细胞的成瘤能力降低。上述结果与前述setdb1的实验结果说明,setdb1通过调控prps1表达进而影响神经母细胞瘤细胞的增殖和成瘤。3.setdb1调控神经母细胞瘤原癌基因n-myc的表达为了研究setdb1引起神经母细胞瘤细胞分化的机制,我们分析神经母细胞瘤临床预后数据库,发现setdb1的表达量在有n-myc扩增的患者中显著高于没有n-myc扩增的患者。n-myc最先在神经母细胞瘤中被证实为原癌基因,它通过影响神经母细胞瘤自我更新和分化能力,对神经母细胞瘤的发生发展产生重要影响。我们通过microarray分析结果发现,下调setdb1,包含n-myc在内的与神经母细胞瘤自我更新能力的相关基因表达下降,进一步通过荧光定量pcr以及westernblot证实,下调setdb1显著的降低了n-myc的表达,说明setdb1的确影响n-myc表达。然后我们在干涉掉setdb1的shep1细胞中过表达n-myc,通过mtt实验以及brdu标记实验可以看出,shep1-setdb1si-n-myc细胞的增殖能力得到一定恢复。最后我们为了研究setdb1与n-myc的调控关系,进行了chip-qpcr实验,结果显示setdb1以及h3k9me3均直接与n-myc启动子上游区域-2885~-2723bp片段直接结合,暗示SETDB1直接调控原癌基因N-MYC,从而影响神经母细胞瘤的增殖和分化。综上所述,SETDB1对神经母细胞瘤细胞的增殖、分化以及自我更新能力都具有重要作用;SETDB1的下调也会显著抑制嘌呤代谢途径关键酶基因PRPS1的表达,ChIP-qPCR实验表明SETDB1能调控PRPS1的表达,因此我们推测SETDB1可能通过调控PRPS1来影响核苷酸代谢,进一步影响细胞增殖。而PRPS1在神经母细胞瘤细胞的增殖中也具有重要作用;SETDB1与原癌基因N-MYC关系密切,SETDB1的表达与N-MYC的表达有正相关性,SETDB1可能直接通过N-MYC参与调控细胞的增殖分化。本研究结果为神经母细胞瘤的临床治疗神经母细胞瘤提供新策略,也丰富了该疾病的理论研究基础。