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背景:Kv1.3通道阻断剂被广泛用于多种人类疾病治疗的研究。然而,相比于小分子药物,具有更高选择性的多肽类Kv1.3通道阻断剂往往不具备跨血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）的能力。BBB,作为复杂的天然屏障,主要负责维持中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的稳态。该屏障一方面保护着机体,另一方面却限制了许多药物在CNS中发挥治疗作用的可能性。因此,寻找协助功能性分子穿过BBB的转运载体至关重要。研究表明,细胞穿膜肽（Cell penetrating peptides,CPPs）能携带多种大分子物质进入细胞或组织中,其中包括多肽。而dNP2作为一种新型CPP,有着比经典CPP更高的转运效率。在本课题组的前期研究工作中,我们筛选得到了高选择性的Kv1.3通道阻断剂多肽ImKTx88,或简称ImK。它能够通过抑制T细胞的活化来有效改善多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）动物模型,实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）大鼠的疾病症状。然而随着疾病的缓解和BBB的修复,多肽ImK无法继续进入CNS发挥抗炎作用。本研究将利用dNP2,构建和表达同时具有跨BBB潜能和抗炎功能的Kv1.3通道阻断剂多肽dNP2-ImK,为Kv1.3通道阻断剂在CNS疾病的应用与CPPs在药物递送系统的应用提供理论基础和实验依据。目的:构建具有跨BBB潜能的Kv 1.3通道阻断剂dNP2-ImK,比较dNP2-ImK与ImK在细胞穿膜能力、跨BBB潜能和抗炎能力上的差异。方法:（1）以含有ImK基因序列的pEGX-6p-1质粒为模板,利用PCR引物获得dNP2-ImK的基因序列。通过双酶切连接反应构建原核基因表达载体pEGX-6p-1-dNP2-ImK,并对阳性克隆进行筛选与测序鉴定。（2）将测序结果正确的重组载体转化至表达菌种E.coli/Rosetta（DE3）中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG）诱导、超声破碎、GST亲和层析、超滤浓缩、酶切反应、高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）纯化、冻干得到纯化的多肽dNP2-ImK。取少量蛋白样品通过Tricine-SDS-PAGE来反映蛋白表达的过程,并通过质谱来精确测定重组多肽的分子量。（3）体外培养293T细胞,将mKv1.3质粒转染至细胞中,利用全细胞膜片钳技术检测dNP2-ImK对Kv1.3电流的影响,探究其对Kv1.3通道的作用。分离大鼠外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,体外给予刺激剂刀豆蛋白A（Concanavalin A,ConA）激活并提前加入不同浓度的dNP2-ImK（100pM,1nM,10nM,100nM）干预。酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测dNP2-ImK对炎性细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17A的分泌的影响。同样条件下,使用10nM ImK和10nM dNP2-ImK分别干预,实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）和ELISA检测ImK和dNP2-ImK对炎性细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17A基因和蛋白水平表达的影响。进而评估ImK和dNP2-ImK的抗炎能力。（4）体外培养人脑微血管内皮细胞（Human brain microvascular endothelial cell,HBMEC）。实验分组,Ctrl组、Dye组、Dye-ImK组、Dye-dNP2-ImK组。分别用含有0.5%DMSO的PBS、1 μM Dye、1 μM Dye-ImK、1 μM Dye-dNP2-ImK 处理 HBMEC 4h。经多聚甲醛固定、Hoechst33258染色后,利用共聚焦显微镜检测细胞中的荧光密度。进而评估ImK和dNP2-ImK的细胞穿膜能力。同时,将HBMEC铺于0.4μm孔径的Transwell小室上层,下层加入PBS。待细胞完全贴壁后,分别加入含有0.5%DMSO的PBS、1μMDye、1μM Dye-ImK、1μMDye-dNP2-ImK处理24h。后收集下室液体,检测下室溶液的荧光情况。进而评估ImK和dNP2-ImK的跨BBB潜能。（5）体外分别培养HBMEC、293T、原代大鼠星形胶质细胞、大鼠PBMC。实验分组:Ctrl组、药物处理组。各组细胞分别用PBS或不同浓度的dNP2-ImK（10nM,100nM,1μM）处理24h。收集细胞上清用于乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）检测。同时,利用细胞计数试剂盒（Cell counting kit-8,CCK8）进行细胞活性检测。进而评估dNP2-ImK对细胞生存率及细胞膜完整性的影响。结果:（1）阳性克隆测序结果显示,翻译后得到的氨基酸序列与预期一致。pEGX-6p-1-dNP2-ImK载体构建成功。（2）HPLC结果显示,目的多肽与融合蛋白被分开,出峰时间分别为14min和28min。Tricine-SDS-PAGE结果显示了蛋白表达的全过程。质谱结果显示,测试样品的质荷比为7068.4 m/Z,对应的分子质量为7067.4道尔顿（Da）,与预期的7067.5Da基本一致。（3）全细胞膜片钳结果显示,dNP2-ImK能显著降低293T细胞中的Kv1.3电流,冲洗后电流恢复,该结果表明dNP2-ImK保留了ImK对Kv1.3通道的抑制作用。ELISA结果显示,dNP2-ImK能显著抑制大鼠PBMC中ConA诱导的炎性细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17A的分泌,且呈浓度依赖模式。RT-qPCR与ELISA结果显示,ImK和dNP2-ImK都能显著抑制大鼠PBMC中ConA诱导的炎性细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17A的基因和蛋白表达,且它们的抑炎能力相近。（4）共聚焦结果显示,Dye-dNP2-ImK组中胞内荧光强度明显高于Dye-ImK组,经统计,Dye-dNP2-ImK组中胞内荧光密度显著高于Dye-ImK组。该结果表明,相比于ImK,dNP2-ImK表现出更强的细胞穿膜能力。Transwell结果显示,Dye-dNP2-ImK组中下室液体的荧光强度显著高于Dye-ImK组。该结果表明,相比于ImK,dNP2-ImK具有更好的跨BBB潜能。（5）CCK8检测和LDH释放检测结果显示,dNP2-ImK处理（10nM,100nM,1μM）不会影响PBMC,293T,大鼠原代星形胶质细胞,HBMEC的细胞生存率及细胞膜完整性。结论:（1）dNP2-ImK能够显著降低293T细胞中的Kv1.3电流,并有效抑制大鼠PBMC中ConA诱导的炎症细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17A的产生与其mRNA的表达。此外,dNP2-ImK与ImK在炎性细胞因子的抑制效果上无差异,且dNP2-ImK处理不影响细胞的生存率。（2）dNP2-ImK在不影响细胞膜完整性的前提下,相比于ImK,表现出较强的细胞穿膜能力和跨BBB潜能,这为我们后续研究dNP2-ImK在EAE动物模型的治疗作用奠定了基础,并提示我们CPPs与缺乏细胞穿膜能力的功能性药物的结合有望成为药物设计的潜在策略。