通过调节关键酶的表达来优化代谢途径是提高代谢工程产物产量和产率的重要途径之一。微生物细胞工厂中通常有数百至数千个代谢反应,它们之间相互作用形成一个庞大且紧密联系的网络。因此,多基因的组合调控是必要的。实现组合调控的方法有很多,例如启动子优化,RBS优化,基因敲除,核糖开关控制等。这些方法需要基因工程来改变工程菌株的遗传信息,操作繁琐,难度较高。另外还有些不依靠基因重组的方法。例如依赖于Hfq的小RNA,反义RNA(asRNA)和RNAi等,通过阻碍mRNA翻译成蛋白质调节基因表达。但是,这些方法具有较为明显的脱靶和细胞毒性。最近,CRISPRi(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference)在基因调控领域引起了很多关注。CRISPRi仅需催化失活的Cas蛋白和嵌合单向导RNA(sgRNA),就可以实现对特定基因表达的抑制,已经被用在越来越多的模型菌株和非模型菌株中,在重塑代谢途径,识别新的高效代谢酶及优化底盘细胞等方面发挥巨大的作用。已经有许多使用CRISPRi来同时调控多基因表达的应用,其中大多数都比单基因抑制得到了更高的产物滴度。然而,这些应用仍处于相对初步的阶段,其通过几个组成型启动子或相同的诱导型启动子同时表达多个gRNA,以实现多基因和多途径的调控。此方法有一些局限性。首先,每个途径的表达不能独立调节。在代谢网络中,每个代谢途径的表达都有其最佳时间和强度。另外,为了找到多基因抑制的最佳组合,需要构建大量的gRNA表达质粒进行筛选,费时费力。本论文旨在通过由三种正交且严谨的诱导表达启动子,来独立调控三种不同gRNA的表达,实现对三种基因的组合及时序调控。实验的主要难点在于CRISPRi系统的灵敏性导致诱导gRNA表达的启动子的轻微泄漏就可以导致对目标基因的表达造成抑制。为了解决这一问题,我们首先对组成系统的启动子进行了筛选和优化。最终得到了泄漏表达水平极低的三个诱导表达系统,将其组成多基因诱导表达系统,作为gRNA的表达平台。在每个启动子下游有两个相同的IIS型核酸内切酶识别位点,可通过基于Golden Gate的一步连接法一次性插入三个基因或spacer。之后使用三种不同的荧光蛋白报告基因对该系统进行检测,表明其具有组合表达及时序表达的能力。第二部分是多基因抑制系统的建立。在三个诱导启动子序列下游分别插入一个gRNA骨架,并在TFs表达质粒中插入dCas9蛋白的基因序列,完成多基因抑制系统的初步构建。该系统实现了对多基因的表达抑制,但gRNA泄漏造成的抑制还是比较严重。于是我们突变了 gRNA骨架以降低其与dCas9蛋白的亲和力,进一步减弱了 gRNA泄漏表达造成的基因抑制。之后我们又从gRNA结合位点,spacer长度和诱导启动子三个方面探究了影响突变gRNA抑制效果的因素,以达到最佳的抑制效果。第三部分是该系统在NeuAc生产中的应用。为表现该系统在代谢工程领域的应用价值,我们将其用在优化NeuAc生产中。我们针对十个与NeuAc前体物质PEP消耗有关的基因设计了靶向位点,表征单基因抑制对NeuAc生产的帮助。接着从中选择了4个靶点,以三个为一组进行组合,构建了多基因抑制的质粒,最终使NeuAc产量提高了 1.41倍。我们构建的基于CRISPRi的多基因组合抑制系统,可以实现三个基因的组合抑制及时序抑制。由于用诱导剂的组合取代了 gRNA的组合,减少了 gRNA表达质粒的构建数量,减轻了工作量,节约了大量的时间及科研资源。同时也可以根据细菌的生长阶段灵活调整基因抑制的程度及时间,避免过度或过早抑制关键基因影响正常生长之类的情况发生,达到最理想的调控效果。