论文部分内容阅读
背景和目的抑郁症(Depression)是一种临床常见的精神障碍疾患,具有高患病率、高致残率、高复发率和高社会疾病负担的特点。当今,抑郁症的病因及病理机制研究仍然缺乏重大突破,其治疗尚缺乏有效治疗手段。大量临床和实验研究提示,应激诱导的免疫/炎性反应激活参与了抑郁症的发病和病理过程。目前,众多来自临床和实验的研究证实了针刺抗抑郁的有效性和安全性,然而其具体作用机制尚不明确。本研究在本团队前期研究基础上,采用慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)模拟抑郁症模型,假设针刺是通过对模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性反应激活效应在上游产生调节作用,进而发挥抗抑郁效应。这是本研究的切入点和创新点。方法将44只雄性SD大鼠随机分为4组:正常组、模型组、艾司西酞普兰组和针刺组。除正常组外,其余各组大鼠均采用慢性束缚应激(CRS)结合孤养模拟抑郁症模型、持续接受21天慢性束缚应激刺激;艾司西酞普兰组大鼠每日在慢性束缚应激刺激前1h进行艾司西酞普兰(30mg/kg)灌胃给药;针刺组大鼠每日在慢性束缚应激刺激前1h进行针刺“百会”和“印堂”穴干预,进行以下研究:(1)针刺干预对CRS大鼠抑郁样行为的影响。各组大鼠分别于0 day、7 days、14 days和21days进行体重(Body weight)监测、糖水偏好实验(Sucrose preference test)和旷场实验(Open field test),观察不同组别大鼠在不同时间点体重变化、体重增加量、糖水消耗量、纯水消耗量、总液体消耗量、糖水偏好指数、水平运动评分和垂直运动评分,观察针刺对CRS大鼠自然生长和整体情况、快感缺乏程度、自发活动和探索行为的影响,探究针刺抗抑郁效应。(2)针刺对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。实验结束(第21天)后,采用免疫组化法观察海马小胶质细胞活化情况;应用TUNEL实验观察海马神经元凋亡情况;采用ELISA法检测各组大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-10和TNF-α表达变化。探究针刺干预对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。(3)基于模式识别受体TLR4/NLRP3信号通路的针刺抗抑郁机制研究。实验结束后,采用Western blot技术观察不同组别大鼠海马TLR4信号通路关键蛋白(TLR4,MyD88,TRAF6,NF-κB p65,TNF-α)和 NLRP3 炎性小体关键蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18)的表达变化;应用RT-PCR技术观察不同组别大鼠海马TLR4、NLRP3、MyD88和NF-κB p65 mRNA表达变化。以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性反应激活为切入点,探究针刺抗抑郁效应机制。结果(1)针刺干预对CRS大鼠抑郁样行为的影响。行为学分析:①各组不同时间点体重和体重增加量变化结果显示:实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义;与正常组比较,模型组大鼠体重变化在7 days、14 days和21 days均明显低于正常组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),模型组大鼠体重增加量在7 days和14days均明显低于正常组(P<0.01;P<0.01);与模型组比较,针刺组体重和体重增加量均值在7 days、14 days和21 days 均明显高于模型组(P<0.01,P<0.01,P<0.01;P<0.01,P<0.01,P<0.05);值得注意的是,针刺组体重均值在7days和21 days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01;P<0.01)。可见,针刺对CRS诱导体重下降的逆转作用早于且在一定程度上优于艾司西酞普兰。②各组不同时间点糖水消耗量、纯水消耗量、总液体消耗量及糖水偏好指数数据分析显示,实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义。随着时间推移应激负荷增加,CRS作为应激源可诱导大鼠糖水消耗量及总液体消耗量下降、糖水偏好指数显著降低(P<0.01;P<0.01;P<0.01),大鼠机体对糖水奖赏的敏感性降低、快感缺乏程度加重。然而,针刺干预有效逆转了 CRS诱导的大鼠糖水消耗和糖水偏好指数降低,增强大鼠机体对糖水奖赏的敏感性、减轻快感缺乏程度,针刺干预表现出明显的抗抑郁效应。③各组不同时间点水平运动评分和垂直运动评分数据分析显示:实验前(0 day),各组基线水平差异无统计学意义。与正常组比较,模型组水平运动评分均值在7 days、14 days和21 days均明显持续低于正常组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),模型组垂直运动评分均值在14 days和21days均明显持续低于正常组(P<0.01;P<0.01),自发活动和探究行为明显受到抑制;与模型组比较,针刺组水平运动评分均值在7 days、14 days和21 days均明显高于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01),针刺组垂直运动评分均值在14days和21days均明显高于模型组(P<0.01;P<0.01)。值得注意的是,针刺组水平运动评分均值在7days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01),针刺组垂直运动评分均值在14 days明显高于艾司西酞普兰组(P<0.01)。可见,针刺对CRS诱导自发活动和探究行为抑制的逆转作用在一定程度上早于艾司西酞普兰。(2)针刺对CRS大鼠海马小胶质细胞活化介导的免疫/炎性反应和细胞凋亡的影响。①各组大鼠海马小胶质细胞活化情况数据分析显示,正常组海马小胶质细胞处于“静息”态。与正常组比较,模型组海马CA1、CA2、CA3和DG区小胶质细胞显著活化,胞体体积增大、突起缩短增粗,活化细胞数量显著增加(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01),且IBA-1阳性细胞显著增加。与模型组比较,针刺组和艾司西酞普兰组活化小胶质细胞和IBA-1阳性细胞显著少于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,针刺干预有效逆转了持续慢性束缚应激诱导海马小胶质细胞活化。②各组大鼠海马CA1、CA2、CA3和DG区观察及TUNEL阳性细胞数据分析显示,正常组海马CA1、CA2、CA3和DG区细胞核呈蓝色、呈均匀分布。与正常组比较,模型组海马CA1、CA2、CA3和DG区均可见较多细胞核呈棕黄色、固缩,细胞分布散乱,模型组海马TUNEL阳性细胞数目较正常组显著增多(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,持续 CRS 诱导海马 CA1、CA2、CA3和DG区神经元凋亡。与模型组比较,针刺组和艾司西酞普兰组海马CA1、CA2、CA3和DG区TUNEL阳性细胞数目显著低于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01)。可见,针刺干预有效逆转了持续CRS诱导海马神经元凋亡。③各组大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-10和TNF-α表达结果分析显示,CRS诱导了血清炎性因子IL-1β、TNF-α显著升高(P<0.01;P<0.01)和IL-10降低(P<0.01);与模型组相比,针刺组和艾司西酞普兰组血清中IL-1β显著低于模型组(P<0.01;P<0.01)、而血清IL-10显著高于模型组(P<0.01;P<0.01)。(3)基于TLR4/NLRP3信号通路介导的免疫/炎性反应激活途径的针刺抗抑郁机制。研究结果显示:①慢性束缚应激诱导了抑郁模型大鼠海马TLR4信号通路关键蛋白(TLR4,MyD88,TRAF6,NF-κB p65,TNF-α)和 NLRP3 炎性小体关键蛋白(NLRP3,ASC,Caspase-1,IL-1β,IL-18)的显著上调表达,并且 TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 也上调显著。值得注意的是,针刺和艾司西酞普兰干预对海马水平免疫炎性反应激活具有显著调节作用。与模型组比较,针刺干预显著逆转了慢性束缚应激诱导海马中TLR4、NLRP3、MyD88、NF-κB、Caspase-1、TNF-α蛋白上调表达水平,针刺组 TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01,P<0.05),而艾司西酞普兰干预对TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平的调节作用差异无统计学意义。此外,与模型组比较,针刺干预对海马TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA也具有明显调节作用,针刺组海马TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达明显低于模型组(P<0.05;P<0.05;P<0.05),而艾司西酞普兰对其调节作用差异无统计学意义。结论(1)应激诱导了 CRS大鼠海马和血清免疫/炎性反应激活,以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活可能是连接应激和抑郁症的关键途径;(2)针刺干预对以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活具有显著调节作用、减缓CRS诱导的海马小胶质细胞活化和神经元凋亡,发挥抗抑郁效应。可见,对以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫/炎性激活进行广泛调节可能是针刺发挥抗抑郁效应的重要途径;(3)值得注意的是,除了同样对CRS诱导的信号通路下游海马水平Caspase-1及血清IL-1β、IL-10等炎性因子表达水平具有调节作用,针刺能对TLR4、MyD88、NF-κB蛋白和mRNA具有显著调节作用,在以模式识别受体TLR4信号通路和NLRP3炎性小体介导的免疫炎性激活效应上游产生调节作用,这可能是针刺抗抑郁效应优势机制所在。但其机制的特异性尚不明确,将是我们接下来的重要研究方向。