近年来肺癌发病率持续升高,已成为恶性肿瘤死因的第一位.而大部分肺癌患者死于肿瘤的复发和转移,因此发现肺癌侵袭、转移的关键靶点具有重要意义。　　 DERL1是一种内质网相关蛋白,它参与错误折叠的蛋白质从内质网释放如细胞浆的过程之中。在内质网应激(ER Stress)的过程中,DERL1的表达水平发生上调,并且能够抑制内质网应激所导致的细胞凋亡。有研究证实DERL1在肿瘤中可以从内质网中渗透到细胞膜上表达,在胰腺癌,肝癌,乳腺癌,结肠癌,食管癌等多种肿瘤中存在DERL1高表达;乳腺癌细胞中研究发现,DERL1在乳腺癌组织中过表达并与肿瘤的淋巴结转移有关,DERL1能减弱药物诱导的细胞凋亡。这些研究提示DERL1可能是促进肿瘤增殖转移的一个重要癌基因。　　 但是DERL1在非小细胞肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系未见文献报道,其对肺癌细胞的作用及其作用机制还不清楚。我们检测非小细胞肺癌中DERL1的表达情况,分析了DERL1表达与临床病理因素的关系,通过干扰肺癌细胞系A549中DERL1的基因表达,探讨了DERL1对肺癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其相关机制。　　 材料和方法：　　 1、组织来源　　 具有完整随访资料的90例原发性非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来自2002年到2005年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人,组织经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。患者术前均未接受放化疗。组织学分类和分化程度根据2004WHO分类标准进行判定,按国际抗癌联盟的肺癌p-TNM分期标准:Ⅰ期38例,Ⅱ期22例,Ⅲa例20,Ⅲb5例,Ⅳ期5例;鳞癌44例,腺癌46例;发生淋巴结转移48例;男性66例,女性24例,年龄33～72岁,平均年龄60岁。　　 2、免疫组织化学染色将石蜡组织块切成4μm厚切片,脱蜡,脱水,按S-P法和抗体说明操作。抗DERL1的多克隆抗体(1:150,sigma)。采用Elivision试剂盒(MaiXin,China)。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:DERL1免疫组化阳性信号定位于细胞浆。我们将1-25％的细胞核或细胞浆核着色记为1分。26-50％记为2分,51-75％记为3分,76-100％记为4分。同时根据染色强度:无染色记为0分,淡染记为1分,黄色颗粒记为2分,棕褐色颗粒记为3分。着色细胞数得分乘以着色强度得分为DERL1得分。我们将得分0-4分记做DERL1阴性,得分5-12分记做DERL1阳性。　　 3、细胞培养与siRNA干扰肺癌细胞系A549,H1299(购自ATCC)均用含10％热灭活新鲜小牛血清的RPMI1640(Gibco,USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素的培养基,在37℃、5％CO2的条件下培养。On-TargetPlus SMARTpool siRNA for DERL1与On-TargetPlus siControl购自Dharmacon。转染前24小时将细胞按50％密度接种于24孔板,采用DharmaFECT1转染试剂进行转染,转染后48小时使用PCR和Western blot检测干扰效率。　　 4、RT-PCR对于培养细胞或新鲜肺癌组织采用RNeasy plus Mini kit from(Qiagen)提取总RNA。采用ABI high capacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)进行反转录。使用ABI7900实时定量PCR仪,并使用DERL1特异性探针检测其在组织与细胞中的含量,内参采用beta actin。　　 5、Western Blot法检测蛋白表达收集细胞及剪碎的新鲜肺癌组织加入裂解液充分裂解,低温高速离心(4℃,12000转/min,30min),提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳(12％SDS-PAGE凝胶)、转印(50V,120min)、5％正常小牛血清封闭,抗DERL1(1:1000 sigma)和抗β-actin(1:1000),4℃孵育过夜,分别与对应的二抗(1:2500,santa cruz,USA)室温孵育2h,ECL显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪(ChemiImager5500,Alpha Innotech,USA)采集,进行灰度值测定。　　 6、MTT法检测细胞增殖及集落形成实验将单个细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔体积200ul含103个细胞,培养24hr,每孔加入MTT(3-[4,5-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)溶液(5mg/ml,Sigma,USA)继续培养4hr,吸去上清液,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振荡10min,490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。集落形成实验在干扰48小时后接种1000个细胞于6cm培养皿中2周后用Giemsa染色.　　 7、细胞迁移和侵袭能力检测用无血清RPMI1640培养基重悬细胞,调至2.5×105个/ml细胞,取100ul加入上室中(孔径8um,Costar,USA),下室加入600ul含10％小牛血清RPMI1640培养基。37℃、5％CO2孵箱中培养6hr后吸尽培养基,PBS清洗后,甲醇室温固定15min,用棉签轻擦掉上表面的细胞,苏木素染色,室温干燥过夜。取下聚碳酸酯微孔膜,置载玻片上,镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清RPMI1640培养基以1:3稀释Matrigel(BD Biosciences,USA)加入上室100ul,在室温下放置3hr。使用前用培养基重新水化并吸净,其他与迁移实验相同,培养18hr后观察结果。　　 8、数据分析　　 采用SPSS10.0统计分析软件,对DERL1表达和临床病理因素的关系用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank检验判断差异性;其它实验结果采用t检验进行数据分析,用均值±标准差表示,P＜0.05为差异有意义。　　 结果：　　 1、DERL1蛋白过表达与非小细胞肺癌分期和淋巴结转移有关。　　 我们采用免疫组化方法检测了DERL1蛋白在90例肺癌及其癌旁正常肺组织中的表达情况。DERL1在正常支气管上皮及肺泡上皮均弱着色,为阴性表达。在90例非小细胞肺癌中DERL1阳性表达为34例,阳性率为37％。阳性信号主要表达于肿瘤细胞的胞浆和细胞膜中。对于临床病理因素进行分析发现DERL1的阳性表达与年龄、性别、分化、肿瘤大小无显著关系。DERL1的阳性表达与肺癌患者的淋巴结转移(p=0.0071),p-TNM分期(p=0.0279)有着显著关系。　　 2、在两种肺癌细胞系中转染DERL1特异性siRNA抑制肺癌细胞增殖和侵袭。　　 我们采用DERL1特异性siRNA干扰其在肺癌细胞系A549和H1299中的表达,通过实时定量PCR检测转染效率。我们发现转染48小时后,与转染乱序siRNA的细胞相比,转染特异性干扰的细胞DERL1的表达明显下降(其中A549干扰效率87％;H1299干扰效率83％)。MTT法测定结果显示,DERL1特异性siRNA干扰的细胞增殖能力明显低于对照组(P＜0.05)。与MTT结果相似,干扰DERL1后A549与H1299细胞的集落数目明显下降。同时,Transwell侵袭实验证明下调DERL1基因表达后,A549及H1299细胞的侵袭能力被明显抑制。　　 3、干扰DERL1下调肺癌细胞中MMP2和MMP9的表达。　　 为了研究干扰DERL1后肺癌细胞侵袭能力下调的机制,我们检测了粘附相关蛋白和侵袭相关蛋白的表达变化。我们检测了MMP2和MMP9蛋白表达量和活性的变化,我们发现,干扰DERL1后MMP2和MMP9的总蛋白和活性蛋白含量均有明显下调。然后我们使用实时定量PCR检测了MMP2和MMP9的mRNA水平变化,我们发现干扰DERL1后MMP2和9在转录水平上出现明显下调。因此,DERL1干扰所致的侵袭能力下调可能是由MMP下调所导致的。　　 4、干扰DERL1通过ERK通路下调MMP2和MMP9转录。　　 MMP2和MMP9的转录调节通常是由ERK通路,p38通路和JNK通路来调节的,我们猜测干扰DERL1可能通过这三者来调控MMP2和MMP9的转录,干扰DERL1后,我们发现p-p38和p-JNK的水平没有发生变化,但是pERK的水平出现明显下调。因此DERL1导致的MMP2和9的上调可能是由ERK通路介导的。我们使用ERK通路抑制U0126和PD98059剂处理A549和H1299细胞后发现MMP2和MMP9的mRNA水平出现明显下调,与干扰DERL1后的趋势一致。此外,我们检测了ERK上游蛋白p-MEK,p-Raf的磷酸化水平,发现干扰DERL1下调了p-MEK和p-Raf,p-MSK。因此DERL1可通过MEK/ERK通路介导MMP2和MMP9的转录.　　 5、干扰DERL1能够抑制STAT通路。　　 此外,我们还检测了干扰DERL后JAK/STAT通路激活状况的变化,干扰DERL1能够抑制JAK/STAT通路关键蛋白STAT3磷酸化水平,我们发现干扰DERL1之后STAT3的磷酸化水平明显下调。以上结果说明DERL1能够同时调节MEK/ERK通路水平和STAT3通路活性水平。　　 6、干扰DERL1下调p-EGFR水平和总EGFR蛋白水平。　　 由于DERL-1能够同时调控MEK/ERK通路和STAT3通路,并且其定位于细胞膜和浆,我们猜测DERL1对这两个通路的调控可能是通过调节EGFR通路活性来实现的。我们检测了干扰DERL1后p-EGFR的水平和总EGFR的蛋白水平,我们发现下调DERL1能够显著下调p-EGFR的磷酸化水平并且下调EGFR的总蛋白水平。干扰DERL降低EGF激活p-EGFR的能力,提示DERL1通过与EGFR相互作用来调节下游通路活性。　　 7、DERL1与EGFR结合。　　 由于干扰DERL1能够下调EGFR总蛋白水平,我们猜测。DERL1可能通过增强EGFR的稳定性来实现对其蛋白水平的调控。我们使用免疫共沉淀发现DERL1蛋白与EGFR蛋白能够直接结合。　　 讨论：　　 DERL1在内质网应激反应中起到了重要作用,DERL1参与了将错误折叠蛋白质从内质网运送到胞浆的过程,DERL1含有4个跨膜结构域,但其氮端和碳端都处于细胞浆中。有研究证实DERL1在肿瘤中可以从内质网中渗透到细胞膜上表达,因此DERL1抗体可以作为肿瘤治疗的新靶点。最近研究发现,DERL1在胰腺癌,肝癌,乳腺癌,结肠癌,食管癌等多种肿瘤中存在着高表达,可能是一个潜在的癌基因;在乳腺癌组织中用western blot和免疫组化的方法检测了DERL1的含量,发现其在肿瘤组织中过表达,并且与肿瘤的分级和淋巴结转移相关。然而,DERL1在肺癌中的表达情况及其与临床病理因素的关系还不清楚。　　 本研究证实了在非小细胞肺癌中DERL1在蛋白水平存在显著上调,DERL1的过表达与肺癌的淋巴结转移和p-TNM分期显著相关。干扰DERL1在肺癌细胞中的表达明显抑制了肺癌细胞的增殖能力和侵袭能力。此外,DERL1通过与EGFR结合,提高EGFR稳定性从而提高p-EGFR通路以及下游STAT通路和ERK通路活性来增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。　　 为了验证DERL1在肺癌中的表达情况,我们通过免疫组化证实其蛋白在非小细胞肺癌组织中过表达,而且DERL1在肺癌中的染色强度明显强于正常支气管上皮并且与肿瘤的转移相关。此外DERL1在肺癌细胞系中的表达高于正常支气管细胞系HBE中的表达。这些结果证实了,DERL1在非小细胞肺癌中存在过表达且DERL1过表达与临床病理因素关系密切。　　 先前的研究发现,诱导内质网应激能够上调DERL1的表达,DERL1基因敲除可以诱导内质网应激反应。在乳腺癌中DERL1能够保护细胞减少内质网应激所导致的凋亡。提示DERL1与肿瘤的生长能力密切相关。不仅如此,转染DERL1还增强了乳腺癌细胞在裸鼠体内的转移能力。但是在肺癌细胞中DERL1是也否存在着这种功能还未证实。我们通过MTT、集落形成和Transwell实验验证了干扰DERL1基因表达后A549与H1299细胞的增殖速度与集落形成能力明显下降,细胞的侵袭能力也明显下调。这些结果进一步解释了DERL1在肺癌组织中与淋巴结转移和p-TNM分期存在显著相关性。　　 DERL1是如何促进肺癌细胞的侵袭转移能力的呢?本研究显示干扰DERL1能够在一定程度上下调MMP-2和MMP-9的表达。MMP-2与MMP-9对细胞外基质的降解和细胞的侵袭能力有重要作用,因此DERL1可通过对MMP的调节来促进肺癌细胞的侵袭能力。我们知道,MAPK通路对MMP2和MMP9的转录具有重要调节作用,因此在干扰DERL1后我们检测了MAPK通路活性,发现p-ERK的水平出现明显下调。因此DERL1可能通过ERK通路来调节MMP。进一步应用ERK通路抑制U0126和PD98059剂处理A549和H1299细胞后发现MMP2和MMP9的mRNA水平出现明显下调,与干扰DERL1后的趋势一致。此外,我们检测了ERK上游蛋白p-MEK,p-Raf的磷酸化水平,发现干扰DERL1下调了p-MEK和p-Raf,p-MSK。因此DERL1可通过MEK/ERK通路介导MMP2和MMP9的转录。　　 另外,我们还发现DERL1可以调控JAK/STAT通路,而JAK/STAT通路和MEK/ERK通路都与EGFR通路相关,而EOFR突变和通路信号增强在肺癌中具有重要作用。因此我们推测。DERL1是通过EGFR调节下游ERK通路,调节MMP2和MMP9的表达进而增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。而进一步实验验证了这一推测,我们发现DERL1可通过与EGFR结合,增强EGFR稳定性从而提高p-EGFR通路活性。　　 综上所述本研究证实了癌基因DERL1在肺癌中呈过表达,并且其过表达与p-TNM分期与肺癌的淋巴结转移正相关,下调DERL1表达能够抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。DERL1通过EGFR调节MEK/ERK通路和STAT3通路,进而调节MMP-2和MMP-9表达,影响细胞侵袭。因此,DERL1在肺癌发展中具有重要作用,可能成为治疗肺癌的候选靶点之一。　　 结论：　　 1、DERL1在肺癌中过表达,并且其过表达与肺癌的淋巴结转移、p-TNM分期呈正相关。　　 2、下调DERL1表达能够抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。　　 3、DERL1通过EGFR调节MEK/ERK通路和STAT3通路,进而调节MMP-2和MMP-9,影响细胞侵袭。