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目的:随着国民经济的不断发展和人民生活水平的快速提高,各种酒精类饮料在生活大量出现。饮酒已成为一种重要的公关或社交手段,除了损害身体外,还导致了更多的精神、心理及各种纠纷或法律案件等社会问题,已成为世界各国普遍关注的焦点。研究表明大量饮酒可直接损伤和/或通过产生的细胞因子间接调节血管的舒缩状态,改变血脑屏障的通透性,影响凝血功能及细胞膜的稳定性和通透性,促进了脑血管意外的发生。在法医学实践中,饮酒后轻微外力或无外力作用下蛛网膜下腔出血的案件时有发生。在此类案件中,体内酒精的作用机制及其参与度已成为法医学重要的研究方向之一,也是此类案件鉴定的关键。
研究表明长期饮酒者体内产生过多的自由基(Free radicals,FRs),损伤细胞膜,破坏蛋白质、酶和核酸等细胞成分,并导致细胞内、外酶类、各种调节蛋白表达异常,参与了疾病和损伤的发生、发展。酒精还可通过还原型辅酶Ⅱ(NADPH)诱导损伤血管内皮细胞,促进NO、ET-1和前列环素(PGI2)等多种物质的释放,从而使血管本身的舒缩功能和状态发生改变。NO与ET-1是体内一对具有调控血管舒缩功能的重要物质,分布广泛,从中枢神经细胞到外周血管都有分布,而且影响其分泌的因素也众多。当两者分泌失衡时就可能造成血管扩张或收缩异常,导致血管意外的发生。介于NO半衰期很短,在血液中不易及时、准确检测,可通过检测能催化产生NO的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)反应NO的表达水平。
本实验拟以急性大量灌酒大鼠模型为研究对象,通过对大鼠行为学、体重和脑组织病理学变化进行观察,并进一步应用免疫组织化学方法研究大鼠脑组织中iNOS和ET-1的表达变化,为酒精参与蛛网膜下腔出血的作用机制及其参与度提供理论基础,也为法医学实践中此类案件的鉴定提供理论依据。
方法:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体重220g士10g,随机分为对照组(n=10)、饮酒各组。饮酒各组根据灌酒时间不同分为7d组、14d组、21d组、28d组(n=10)。用市售56%v/v北京红星二锅头白酒制备急性大量灌酒大鼠模型,采用灌胃器灌胃,每天2次,间隔10小时。实验前各组均给予适应性蒸馏水灌胃1周。饮酒各组每次按1.2mL/100g剂量灌注。对照组用等体积蒸馏水代替白酒进行灌胃。实验期间观察大鼠行为学和体重变化。饮酒各组分别于末次灌胃后2小时迅速麻醉断头处死。取脑后分别在视交叉后2mm处和大小脑分界处将脑组织分为三部分制作石蜡切片,进行HE染色观察大鼠脑组织病理学改变;进一步应用免疫组织化学方法观察大鼠脑组织iNOS、ET-1的表达变化。
采用Media Cybemetics公司IPP图像分析软件,对iNOS、ET-1表达水平进行积分光密度测定,结果以均数士标准差(Mean士SD)表示,用SPSS16.0统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),用最小显著差法(LSD)作两两比较,以p<0.05为有显著性差异。
结果:
1行为学改变及体重变化
1.1行为学改变
对照组灌胃后活动、进食无明显变化;饮酒各组大鼠随灌胃时间的延长,可出现不同程度的神经系统异常表现:兴奋性增加,动作活跃,平衡性差,反应性差,嗜睡甚至瘫软。
对照组大鼠一般状况良好,毛色光滑,行动自如、灵活,进食与以前变化无差异,排便干燥、球状;随着实验的延长,饮酒各组大鼠皮毛暗淡无光,外形杂乱,活动性差,反应性不灵敏,进食量减少,大便稀疏。
1.2体重变化
对照组大鼠体重逐渐增加;随着时间延长,饮酒各组大鼠体重增长缓慢,28d组体重与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。
2 组织病理学改变
2.1脑组织HE染色
对照组:脑组织结构清晰,细胞排列整齐,形态规则。饮酒各组:随着灌酒时间的延长,大脑皮层神经元水肿,排列紊乱,细胞周围间隙增大,细胞核固缩浓染,蛛网膜下腔血管淤血,28d组可见嗜神经元现象。
2.2iNOS免疫组织化学结果
对照组:脑组织内少数神经细胞、胶质细胞iNOS呈阳性表达,脑动脉和实质内微小血管未见iNOS阳性表达。饮酒各组:21d组和28d组脑组织内胶质细胞和神经细胞iNOS阳性表达增强,与对照组比较有明显差异(21d组p<0.01,28d组p<0.05);在脑动脉内皮细胞和平滑肌细胞及脑实质微小血管内皮细胞中,21d组、28d组可见iNOS明显阳性表达。
2.3ET-1免疫组织化学结果
对照组:脑组织内少数神经细胞及胶质细胞ET-1呈阳性表达。饮酒各组:14d组ET-1在神经细胞与小胶质细胞中阳性表达增强,与对照组有显著差异(p<0.01);21d组ET-1表达较14d组减少,但仍高于对照组,有差异(p<0.05);仅个别脑实质小血管内皮细胞有小量ET-1阳性表达。
结论:
1 急性大量灌酒后大鼠脑组织iNOS、ET-1呈阳性表达,并随灌酒时间延长呈动态变化。
2 上述改变可能是急性大量饮酒引起脑血管功能紊乱并导致蛛网膜下腔出血的机制之一。