随着人民生活水平的提高,同时具有治疗与预防作用的“药食两用”药材受到人们广泛关注。中药材的真伪与药用成分含量是保证药材品质与疗效的基础。一方面,近年来中药产品中原料药材掺假造假问题频发,严重阻碍了中医药产业的发展,进一步影响了中药在全球的声誉。DNA条形码已广泛应用于药用植物、中药材及饮片的鉴定,然而其不适合经过各种深加工,导致DNA严重降解的中药产品的鉴定。为解决DNA降解的材料的鉴定,本文提出了“分子身份证”的概念,即利用一段长为20-50bp特异性短片段,对混合物中某特定物种进行鉴定;本研究基于大样本量ITS2序列分析,开发了正品当归及肉苁蓉药材混淆品(锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉)的分子身份证,并为当归、肉苁蓉产品的快速准确鉴定提供了依据。(1)当归是常见妇科用药,本文收集了 265份当归及其近缘种、混淆品样品。对ITS2序列进行分析,找到了当归特有的SNP位点,开发了一段长为37-bp的“分子身份证”片段(5’-AATCCGCGTCATCTTAGTGA GCTCAAGGAC CCTTAGG-3’),应用网上当归属72个物种的573条序列,对此“分子身份证”进行验证,证实为当归特有序列,未知物种与当归分子身份证序列100%一致,则判断为当归,若存在一个碱基以上的变异,则判断不是当归,并设计引物扩增获取此分子身份证区域。对当归粉、提取物和中成药的鉴定结果表明:网上购买的14份当归粉中,有7份被独活替代。对28批含当归中成药中,仅19个批次可判断含有当归,其他批次中还检出了独活、羌活等非标签成分。(2)肉苁蓉是常见滋补佳品,来源于肉苁蓉及管花肉苁蓉两种基原植物。本文对251份肉苁蓉和混淆品样品进行了 DNA提取,同NCBI中325条相关ITS2序列共同分析。以四种常见混淆品(锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉)的SNP位点为基础,分别开发了 4个长度范围在30～37bp的肉苁蓉混淆品的“分子身份证”,并设计了 6对物种特异性引物扩增获取分子身份证区域,对66种肉苁蓉提取物和中成药的鉴定结果表明:“分子身份证”可成功鉴定混合物中的目标物种,约36.4%的产品中检测到非标签成分,其中肉苁蓉中掺杂锁阳是市场最常见现象。除此之外,如何提高药材品质与疗效也是当前研究的热点,提高药用成分即药材中次生代谢产物的含量成为其中的研究方向之一。“药食两用”药材川贝母资源匮乏,被列入国家三级保护植物名单。近年雾霾天气频发,更加剧了对其资源的需求。其活性成分贝母辛、贝母甲素等属于异甾体类生物碱,目前关于其生物合成途径尚不明确。太白贝母(Fritillaria taipaiensis)是适合低海拔栽种的川贝母基原物种,且甾体生物碱种类含量与川贝母一致。长期以来,一直缺乏对太白贝母基因组、转录组及其相关基因的研究。(1)本研究对太白贝母进行了首次转录组测序。利用2×125 Pair End Illumina测序获得的94,396,694(～11.4 Gb)高质量reads,共组装成190,350个转录本。利用多个数据库进行功能注释,识别出一系列与甾体类生物碱生物合成相关的基因,以及其他次生代谢产物途径,包括甾醇和萜类生物合成途径,以及重要的下游氧化还原酶(如CYP450s)。(2)使用qRT-PCR对甾体类生物碱合成相关酶基因进行了验证,结果表明这些候选基因参与了组织特异性表达。通过对表达结果的分析,相对于叶片而言,鳞茎更有可能是甾体类生物碱上游生物合成途径的主要部位,同时推测包括CYP450s等催化氧化还原反应在内的下游反应可能也发生在鳞茎中。(3)本文成功构建了甾体生物碱合成途径上的5个关键酶——HMGS,HMGR,DXS,ispH,CAS以及待选的氧化还原酶包括CYP450超家族酶(CYP90B1、CYP90D2),DWF5,DWF1,FK的基因及酿酒酵母或大肠杆菌的表达载体,并诱导了表达载体的蛋白表达,同时探讨了不同诱导条件对蛋白表达的影响。综上,本研究从两个角度对“药食两用”药材进行了研究,一方面开发了当归正品及肉苁蓉四种混淆品分子身份证,并建立了分子身份证鉴定中成药的方法,进一步拓宽了 DNA条形码的研究范畴;另一方面建立的完整的转录组数据将作为一个资源,用于识别潜在的候选基因操作靶向生物活性代谢物,也有助于开发功能相关的分子标记,加快对太白贝母的分子育种和保护工作。本文已构建成功了多个关键酶基因的表达载体,后续将对其催化活性进行分析并确定其功能,为进一步研究甾体生物碱的生物合成奠定基础。