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研究背景背根神经节(DRG)在神经病理性疼痛的发病机制中起着重要作用。许多研究证明背根神经节的电压门控钾离子通道(Kv)是决定神经元放电频率和和峰电位持续时间的关键因素,Kv1.2属于Kv1通透型亚型,参与形成Kvα四聚体,在背根神经节中大量表达。周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛模型(如CCI模型)中,DRG神经元Kv1.2mRNA及蛋白表达下调,电流下降,兴奋性增强。最近研究发现,Kv1.2AS RNA (Kv1.2基因的长链非编码RNA)可负性调控Kv1.2基因(Kcna2)的表达,其基因启动子区含有髓样锌指蛋白1(MZF1)特异性的结合基序(161AGTGGGGA154)。SNL模型中,MZF1表达升高,与Kv1.2AS RNA基因启动子特异性基序(161AGTGGGGA154)的结合活性增强,结合量增多,更为重要的是,MZF1mRNA和Kv1.2AS RNA共同表达于DRG神经元。体外HEK-293T细胞和DRG细胞MZF1过表达或沉默时,Kv1.2AS RNA表达增高或降低,Kv1.2mRNA及蛋白表达下降或上调,这和脊神经结扎(SNL)或坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型中MZF1、Kcna2antisense RNA、Kcna2mRNA表达情况类似,上述说明MZF1可能对Kcna2antisense RNA基因的表达起着重要的调控作用,是病理性疼痛的潜在调节靶点。鉴于体内环境的复杂性,体外实验毕竟不能完全模拟体内过程,体内DRG MZF1与神经病理性疼痛的关系,目前尚不清楚。研究目的本研究通过大鼠在体DRG显微注射(Microinjection),上调或沉默DRGMZF1基因表达,观察大鼠疼痛行为学变化,检测MZF1、Kv1.2AS RNA、Kv1.2mRNA及蛋白表达变化,研究MZF1对DRG神经元电流和兴奋性的影响,确认体内DRGMZF1-Kv1.2AS RNA-Kv1.2mRNA通路和外周神经损伤诱导的神经病理性疼痛的关系,初步探讨针对DRG MZF1基因靶点进行干预治疗的可行性。研究方法1.雄性SD大鼠随机分为实验组(MZF1过表达组)和对照组(EGFP组),实验组DRG注射rAAV5-MZF14×1012GC/μl,对照组DRG注射rAAV5-EGFP4×1012GC/μl;于DRG注射前1天和DRG注射后1、3、4、6、8周完成后肢左右足机械性缩足反射阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷缩足潜伏期(CWL)测定后,取双侧L4-5DRG,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定大鼠L4-5DRG MZF1mRNA、Kv1.2AS RNA、Kv1.2mRNA表达,用Western-blot检测大鼠L4-5DRGMZF1、Kv1.2蛋白表达。2.雄性SD大鼠随机分为实验组(MZF1过表达组)和对照组(EGFP组),实验组rAAV5-MZF1和AAV5-EGFP混合液2μl(4×1012GC/μl,1:1混合)DRG注射,对照组AAV5-EGFP2μl (4×1012,GC/μl)DRG注射,5周后急性分离L4-5DRG神经元,全细胞膜片钳记录MZF1过表达对DRG神经元兴奋性的影响。3.雄性SD大鼠随机分为4组:PBS+CCI组(空白对照组):PBS2μl DRG注射7天后,制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤模型(CCI);MZF1siRNA+Sham组:MZF1siRNA(10μmol/L)2μlDRG注射7d后,仅暴露坐骨神经但不结扎;MZF1siRNA+CCI组:MZF1siRNA(10μmol/L)2μlDRG注射7d后,制备CCI模型;MZF1scramble+CCI组(错义序列组siRNA):MZF1scramble(10μmol/L)2μl DRG注射7d后,制备CCI模型;四组大鼠分别于DRG注射前、CCI手术前CCI术后3、5、7天分别测定后肢左右两足MWT、TWL和CWL。行为学测试完成后,取双侧L4-5DRG,用RT-PCR检测大鼠L4-5DRG MZF1mRNA、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA表达,用Western-blot检测大鼠L4-5DRG MZF1、Kv1.2蛋白表达。4.雄性SD大鼠随机分为4组:CCI+PBS组:制备CCI模型7天后,行PBS2μl DRG注射;CCI+EGFP组:制备CCI模型7d后,行AAV5-EGFP (4×1012)2μl DRG注射;CCI+MZF1siRNA组:制备CCI模型7d后,行MZF1siRNA(10μmol/L)2μl DRG注射; CCI+MZF1scramble组:制备CCI模型7d后,行MZF1scramble(10μmol/L)2μlDRG注射;四组大鼠分别于CCI制备前1d、术后7d(DRG注射前),术后14d,17d分别测定左右后肢MWT、TWL和CWL。研究结果1.单侧L4-5DRG注射rAAV5-MZF1后,同侧大鼠后足机械性缩足反射阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷缩足潜伏期(CWL)出现时间依赖性降低,4周后显著性降低,至少持续DRG注射后8周,同侧MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2AS RNA表达显著升高,Kv1.2mRNA和蛋白的表达显著降低,对侧未出现行为学和上述分子的变化。2. DRG MZF1的过表达显著增加细胞膜静息电位,降低动作电位发放的注入电流的阈值,增加大、中型DRG神经元的动作电位数。3. CCI增加同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和Kv1.2AS RNA的表达,减少Kv1.2mRNA和蛋白的表达,DRG注射MZF1siRNA后,显著阻断CCI诱导的同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2AS RNA增高,翻转CCI诱导的同侧L4-5DRG神经元Kv1.2mRNA和蛋白表达下调,减轻CCI术后3、5、7天(thedevelopment)的机械性痛觉过敏,热痛觉过敏,冷痛觉过敏。MZF1siRNA DRG注射显著减少同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2AS RNA的表达,增加同侧L4-5DRG神经元Kv1.2mRNA和蛋白的表达,但MZF1siRNA错义序列DRG注射,并未影响CCI引起的同侧L4-5DRG神经元MZF1、 Kv1.2AS RNA和Kv1.2表达变化,也未减轻CCI诱发的机械、热、冷痛敏反应。4. MZF1siRNA DRG注射后显著减少CCI诱导的神经病理性疼痛维持期的机械、热和冷痛觉过敏。研究结论DRG MZF1通过Kv1.2AS RNA负性调控Kv1.2蛋白的表达,参与神经病理性疼痛的发展和维持过程,DRG MZF1可能是神经病理性疼痛预防和治疗的潜在靶点。