肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的高发恶性肿瘤。因此,迫切需要探索治疗肝癌的新型药物。植物已被用作抗癌药物资源,并且许多来自植物的抗癌药物已经被报道。栝楼(Trichosanthes kirilowii)是广泛分布于我国各地的一种草本植物。栝楼具有多种生物活性成分,例如萜类化合物,固醇,类黄酮,含氮化合物和木材脂蛋白。大量研究表明,这些化合物具有多种药理活性,包括抗心肌缺血,抗缺氧,抗血小板聚集,抗炎,抗氧化作用和细胞毒性等。TKP是从栝楼果实中提取出的一种低毒抗肿瘤活性蛋白,它是一种丝氨酸蛋白酶。研究表明,TKP有显著的抗大肠癌活性,并且TKP可以通过PI3K/AKT介导的线粒体途径诱导大肠癌细胞凋亡。但是TKP对肝癌的影响尚未有研究。本研究旨在研究TKP对肝癌细胞增殖的影响,并进一步阐明其分子机制。主要研究内容包括以下几方面:第一部分:TKP对肝癌细胞增殖和有氧糖酵解的影响。分别用浓度为0、2.5、5、10、20和40μg/mL的TKP处理肝癌细胞Bel-7402,HepG2和肝正常细胞HL770224 h,之后用MTT法检测肝癌细胞存活率。MTT结果表明,TKP对肝癌Bel-7402和HepG2细胞存活有显著的抑制作用,但对正常肝细胞HL7702的存活没有明显影响。细胞克隆形成实验进一步验证了TKP对肝癌细胞增殖的影响。用浓度为0和2.5μg/mL的TKP处理肝癌Bel-7402和HepG2细胞,7 d后用浓度为0.1%的结晶紫染色,染色结果显示,TKP可以显著抑制肝癌Bel-7402和HepG2细胞的克隆形成能力。分别用浓度为0、2.5、5和10μg/mL的TKP处理肝癌Bel-7402和HepG2细胞24 h,收集培养液后,培养液中葡萄糖残余量以及乳酸产量分别通过葡萄糖和乳酸试剂盒进行测量。结果显示,培养液中葡萄糖残余量显著上升,而乳酸产量明显下降。此外,我们还用实时荧光定量PCR法检测了有氧糖酵解中的关键蛋白:乳酸脱氢酶LDHA、丙酮酸脱氢酶激酶PDK和葡萄糖转运蛋白1 GLUT1的mRNA水平。检测结果显示,TKP处理以后,LDHA、PDK和GLUT1的mRNA水平均显著下调。这些结果表明TKP能够显著抑制肝癌细胞增殖和有氧糖酵解。第二部分:TKP通过调节PKM2抑制肝癌细胞有氧糖酵解。用浓度为0、2.5、5和10μg/mL的TKP分别处理肝癌Bel-7402和HepG2细胞24 h后,Western印迹法检测TKP对肝癌Bel-7402和HepG2细胞中丙酮酸激酶PKM2的影响。结果显示,TKP以剂量依赖的方式显著抑制总PKM2蛋白水平,并且TKP处理后,PKM2在细胞核和细胞质中的蛋白水平均明显降低。此外,我们还检测了TKP对肝癌细胞PKM2丙酮酸激酶活性的影响,结果显示,TKP显著抑制PKM2的酶活性。这些结果表明TKP明显抑制PKM2的表达,核易位和丙酮酸激酶活性。为了进一步证实PKM2在TKP诱导的有氧糖酵解抑制中的关键作用,我们在Bel-7402和HepG2细胞中过表达PKM2,然后检测培养液中葡萄糖和乳酸含量,结果发现由TKP处理而导致的葡萄糖消耗和乳酸产量的下降得到了明显的逆转。此外,过表达PKM2导致GLUT1、PDK和LDHA的表达水平显著增加。这些结果表明,TKP通过调节PKM2的表达进而抑制肝癌细胞有氧糖酵解。第三部分:TKP通过抑制β-catenin/c-Myc/hnRNPA1途径调节PKM2、肝癌细胞增殖和有氧糖酵解。分别用浓度为0、2.5、5和10μg/mL的TKP处理肝癌Bel-7402和HepG2细胞24 h后,用实时荧光定量PCR法检测β-catenin、c-Myc和hnRNPA1的mRNA水平,结果显示,TKP处理后,β-catenin、c-Myc和hnRNPA1的mRNA水平明显下调。采用LiCl上调β-catenin的蛋白水平后,实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测β-catenin、c-Myc和hnRNPA1的mRNA水平和PKM2的蛋白水平。结果显示,加入LiCl后,β-catenin、c-Myc和hnRNPA1的mRNA水平显著上调,并且TKP对PKM2的表达和核易位的抑制作用也得到明显的逆转。同时,TKP作用导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少在LiCl处理后也得到逆转,而有氧糖酵解的关键蛋白GLUT1,PDK和LDHA的mRNA表达水平也显著增加。MTT检测结果显示,LiCl和TKP共处理可以减弱TKP对肝癌细胞增殖的抑制作用。这些结果表明TKP通过阻断β-catenin/c-Myc/hnRNPA1途径来调节PKM2,进而抑制肝癌细胞增殖和有氧糖酵解。综上所述,TKP通过抑制β-catenin/c-Myc/hnRNPA1途径调节PKM2的表达,从而发挥对肝癌细胞增殖和有氧糖酵解的抑制作用。