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葡萄糖氧化酶(GOD)广泛存在于动植物和微生物中,虽然天然酶的产量比较低,但是通过基因工程技术,GOD已达到大规模的工业生产,目前,GOD在食品工业、医药、饲料添加剂、检测试纸、生物传感器等方面都有很重要的用途。甲硫氨酸是蛋白质必需氨基酸之一,甲硫氨酸的残基易被氧化形成甲硫氨酸亚砜,甲硫氨酸亚砜被氧化为甲硫氨酸砜,此过程是不可逆的,当蛋白质中的甲硫氨酸被氧化后会使原来的结构和功能发生改变,是其失活。因为GOD将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢是一种强氧化剂,会对葡萄糖氧化酶内部的甲硫氨酸残基产生影响,本课题研究的内容是:设计定点突变,在保持葡萄糖氧化酶的活力的同时,提高葡萄糖氧化酶的抗氧化性。酶分子改造技术主要分为理性设计策略和非理性设计策略。非理性设计策略主要是指蛋白质定向进化技术,主要方法有易错PCR、交错延伸重组和DNA改组等。理性设计需要对酶的空间结构和催化机理了解的非常充分,在此基础上对酶的结构进行精确的调控,从而获得所需的酶。酶的理性设计主要包括基于实验结果的实验设计和计算机辅助设计。基于实验结果的设计方法主要有定点突变、loop改造以及催化金属离子替换。目前酶分子改造技术常用的是非理性设计策略,即蛋白质定向进化技术,是最为有效,用的最广泛和成熟的改造酶和获得新酶的方法。蛋白质定向进化技术在提高酶的催化活性和稳定性,改变酶的底物特异性和对映异构体特异性方面取得了很大的成功。但是,由于理性设计的目的性更强,也更为快捷高效,并且随着近些年来,更多蛋白质的三维结构得到解析,一系列的蛋白质的空间结构和催化中心以及催化机理得到确定,理性设计在酶分子改造中应用的越来越多。理性设计策略和非理性设计策略两者结合起来是未来酶分子改造的发展方向,定向进化可以为酶的改造进行初步筛选,理性设计则可以在此基础上进一步对酶特定的位点进行改造,使其达到预期目的。本实验采用理性分析的方法,计算机模拟设计了 GOD的三个突变体,通过同源建模分析其三级结构,运用FlexibleDocking和CDOCKER程序使其和底物进行分子对接。将设计的突变基因和pPIC9K质粒重组,将重组质粒转化到毕赤酵母GS115中,摇瓶表达120h后,离子交换层析发酵的粗酶液,分别检测其酶活和抗氧化性。本研究测得GOD的酶比活力为3.24u/ug,,第一个突变体为将GOD上8个甲流氨酸(MET)全部突变为亮氨酸(LEU),检测突变体没有氧化活性。第二个突变体GOD-M523L-M524L酶比活力为0.0457u/ug,酶活和抗氧化性均都比野生型降低很多。第三个突变体GOD-M524L-M528L酶比活力为 3.59u/ug。GOD-M524L-M528L 的比活力比 GOD 高 10.8%。GOD 和GOD-M524L-M528L在过氧化氢下处理3.5h后,GOD的残留酶活只有20%,而GOD-M524L-M528L的抗氧化性则达到30%,突变体GOD-M524L-M528L的酶活性和抗氧化性都比GOD高。